自闭症研究前沿-诊断治疗新视野

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自闭症研究前沿诊断治疗新视野
Frontiers in Autism Research
New Horizons for
Diagnosis and Treatment

主编Valerie W Hu
主译孔学君(Xue-JunKong)

人民卫生出版社

自闭症研究前沿诊断治疗新视野

Frontiers in Autism Research
New Horizons for Diagnosis and Treatment
主编 Valerie W Hu
主译孔学君(Xue-JunKong)
译者董存建孔建丁岩陈一心刘君宋瑞曹瑾周扬孙睿睿丁信嘉潘娜石寰王一迪李莎莎
人民卫生出版社

Copyright C2014 by World Scientific Publishing Co.Pte.Ltd.All rights reserved.This book,or parts thereof,may not be reproduced in any form or by any means,electronic or mechanical,inclu- ding photocopying,recording or any information storage and retrieval system now known or to be in- vented,without written permission from the Publisher.
Simplified Chinese translation arranged with World Scientific Publishing Co.Pte Ltd.,Singapore. 图书在版编目(CIP)数据
自闭症研究前沿：诊断治疗新视野/(美)瓦莱丽 · W ·胡(Valerie W.Hu)主编；孔学君主译.—北京：人民卫生出版社，2017
ISBN       978-7-117-24470-1
I.①自 …Ⅱ.①瓦…②孔 …Ⅲ.①小儿疾病-孤
独症-诊疗IV.①R749.94
中国版本图书馆CIP数据核字(2017)第081817号

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图字：01-2017-2916

自闭症研究前沿：诊断治疗新视野

主译：孔学君
出版发行：人民卫生出版社(中继线010-59780011)
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邮编：100021
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经销：新华书店
开本：710×1000 1/16 印张：32
字数：591千字
版次：2017年5月第1版2017年5月第1版第1次印刷
标准书号：ISBN 978-7-117-24470-1/R ·24471
定价：152.00元
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序

自闭症是一种复杂的神经发育疾患，近年发病率一路飙升，由于病因大多不清并缺乏特效治疗，该病症日益严重地困扰着迅速增多的患者及其家庭，已成为名副其实的公共健康危机。
自闭症的流行趋势、复杂的生物学机制及高度异质性，使其成为当今医学领域的难点和热点。近年来，自闭症研究方兴未艾，日新月异，知识爆炸之势令人目不暇接。Valerie Hu教授主编的这部《自闭症研究前沿：诊断治疗新视野》,汇集了几十位世界顶级专家，参加撰写了26个章节，涵盖了自闭症领域最新的研究进展，从基因到表观遗传，从生理机制到靶向治疗，从生化代谢到诊断标记，从动物模型到临床实验，是当今内容全面、权威的自闭症专著之一。同时，本书布局完美，条理分明，每章前面有内容摘要，最后有“未来方向”和“本章要点”,使读者很容易掌握精髓；各章还有上百篇参考文献供有兴趣者深度钻研。我们认为，不论是对于自闭症专业人士还是自闭症患儿家长而言，本专著都是一部不可多得的教材。它不仅可以提高我们对自闭症的认识，开阔我们的眼界，而且可以使我们得到很多启迪。这也是我决定翻译此书的初衷，热切希望它在您的探索之路上助您一臂之力。
我要在此感谢所有参加本书翻译及校译的同仁们，感谢他们所付出的宝贵时间和精力，感谢他们奉献的才华和心血，特别感谢董存建、孔建、丁岩、陈一心、刘君在专业校对及组织上给予的大力协助，感谢王一迪、丁信嘉、潘娜、石寰、周洋、宋瑞、李莎莎、曹瑾、孙睿睿的辛勤付出，还要感谢尹跃平、肖密的校对帮助。我要感谢我的先生王晓春对书中插图翻译、编辑方面的帮助及其他方面的大力支持。翻译的过程是再创造的过程，虽然几经推敲，但由于中英文表达的差异，用词欠准之处在所难免，望读者见谅并指正。我也借此感谢ValerieHu教授提供的指导和鼓励，感谢人民卫生出版社饶红梅编辑在翻译格式等方面的指导。最后但是最重要的，我要感谢我的儿子王睿萌，感谢他把我带入自闭症领域，成就了我对这个领域永恒的热情、执著和追求。从一个具有严重行为问题的自闭症患者到成绩优秀的大学二年级学生，儿子的成长道路见证了自闭症的希望。自闭症不是一成不变的，只要您站在科学巨人的肩膀上，就一定可以找到个体化的最佳治疗和康复方案。

——孔学君
2017年3月3日完稿于美国波士顿

前言

自闭症谱系障碍(ASD) 已迅速成为影响儿童和成人的最常见的神经发育障碍之一。尽管ASD 发病率迅速上升，具有相关的高遗传性，但人们对其病因学、病情发展，以及许多可能增加 ASD的风险因素，不论是内在的还是环境的因素，仍知之甚少。目前，既没有经过验证的生物标志物用于诊断筛查，也没有针对 ASD特效的药物治疗。因为大多数ASD个体的病因是未知的，所以诊断主要依据功能和行为异常的报告，大多数医疗也采用反复尝试的方法。这种不确定性的部分原因是ASD相关的临床和表型高度异质性。人们已在鉴定已明确的基因、代谢途径、细胞和组织功能方面的研究取得了进展，并且有证据表明，针对这些遗传缺陷或功能通路障碍的一些靶向治疗已使这个谱系中某些亚组患者的预后得到改观。
本书重点介绍了ASD研究的新兴领域，及其对开发更好的诊断方法和有效的治疗手段的潜能。这些以患者为主要考量的研究领域涉及创新和整合基因/基因组分析，以及表观遗传学影响的探讨，包括非编码RNA、DNA 甲基化、选择性剪接、RNA 编辑的作用、基因调控和表达的错译、代谢和免疫功能失调、共病及激素和基因-环境间的相互作用可能造成的ASD致病风险增加。
本书还介绍了靶向或个性化治疗的进展及新型和替代性干预，例如经颅磁刺激、音乐和艺术治疗。此外涉及成人ASD患者这一在自闭症领域内被严重忽视的人群的研究，讨论了ASD 患者在其人生不同阶段中改善病情和生活质量的目标。各章节中出现的共同主题包括：①应减少目前研究的ASD人群的异质性，以便更明确特定亚组的病理状况以进行靶向性治疗；②认识可被功能失调基因和环境影响的大规模基因调控的重要性；③需要采取全身系统方法治疗自闭症谱系上的患者，同时要考虑到个体差异和可行性。
在每一章里，专家们回顾了在他们相关领域里的最新研究，同时展望了这些领域的发展方向，其中包括会遇到的挑战、需要何种类型的研究或进展以推动该领域的发展进而达到预期的目标。这些独特的前瞻性论点为将来的自闭症研究提供了聚焦点并发人深省，而各章末的“每章要点”提纲挈领地突出了每章的主要内容。在我们探索自闭症研究的前沿时，谨记William Bragg 爵士 (诺贝尔物理学奖，1915年)的睿智建议也是很重要的：“科学中最重要的事情不在于获得新的事实，而在于发现新的思维方式”。
由于许多章节都展现了新的治疗策略和其他可行的干预方法的研究，我

6    前言

们预期本书不仅对从事自闭症研究的学生和资深科研人员具有参考价值，而且还会使社会大众，尤其是那些ASD 患者的亲属和照顾病患的专业护理人员从中受益。
最后，我要感谢所有作者为撰写本书所付出的宝贵时间、专长和精力，以及所有世界顶级科学家帮助我使本书的问世成为现实。最后但同样重要的是，我要感谢我的儿子Matthew Hu-Smith,为我的自闭症研究不断提供了灵感和动力。

Valerie W.Hu
(王一迪译，刘君孔学君校 )

主译

孔学君，哈佛大学医学院附属贝斯以
色列医院主治医师，哈佛大学医学院附属麻省总医院课题负责人(PI), 美中医学交流协会会长，治愈自闭症研究所所长，机体- 大脑康复中心共同创始人。孔医师本科及研究生毕业于北京医科大学医学系(现为北京大学医学部),先后在北京大学第一医院及美国马萨诸塞大学医学院的教学医院完成内科住院医师训练，并在美国塔芙兹 (Tufts) 医学院新英伦医学中心完成博士后研究，1997年后一直在哈佛大学医学院附属医院从事临床、教学及科研工作。2000 年儿子被诊断为自闭症后专注于自闭症研
究并建立了自闭症专业门诊，多年来致力于循证医学、系统生物学、中西医结合为基础的自闭症诊疗及康复，并开创了自闭症全科诊疗模式及医学评估套餐，取得可靠的临床疗效。孔医师的研究兴趣主要在自闭症早期诊断方法、病因探讨及分型，涉及肠道和口腔微生物及基因研究、生物标记物、电生理、影像及新兴疗法的临床试验，寻找早期诊断指标及靶向治疗。2008年创立《北美医学与健康》与《北美医学与科学》杂志并任主编。组织出版自闭症学术专刊 6期，发表数十篇论文。2015年主译其哈佛同事Martha Herbert的自闭症畅销书《自闭症革命》,人民卫生出版社出版。多年来组织自闭症国际论坛，并经常回国讲学，开展国际合作，2014年向深圳引进哈佛自闭症专家组成的团队并担任主任，作为主要申请人获批深圳市“三名工程”基金，并同深圳妇幼保健院共建深圳自闭症中心开展医教研合作。孔医师的初衷是把哈佛的经验和知识带给国内的自闭症患者及其家庭，从深圳到全国，更好地服务自闭症社区。

主编

Valerie W.Hu博士是美国华盛顿特区乔治华盛顿大学医学和健康科学学院的生物化学和分子医学教授，也是一名自闭症谱系障碍(ASD) 患者的母亲。 Hu 博士作为一位化学家，拥有加州理工学院化学博士学位和夏威夷大学化学学士学位。她在
跨学科研究方面有着长期的研究历程，专注于蛋白质结构-功能关系和细胞膜-蛋白质相互作用。2004年底，由于对 ASD 的个人兴趣，她将她的研究重点转向自闭症。 Hu 博士自此成为将多学科综合基因组学方法应用于ASD的领军人物，专注于整合来自基因表达、行为、遗传和表观遗传学分
析的大规模数据资料。她研究的主要目标是基于生物标志物诊断和对于自闭症患者的个性化治疗，实现这些目标需要更好地理解导致自闭症不同表现的潜在的病理生物学机制。揭示这些病理生物学机制，一部分通过识别ASD的不同亚型中改变的基因、功能失调的通路和异常的基因调节机制，同时需要识别 ASD的环境风险因素。Hu 博士希望本书中体现的自闭症研究及其展望有助于阐明这些过程，引出更早期和更明确的诊断、基于证据的治疗选择，最终使所有ASD患者的人生更加丰富充实。

作者名录

Argel Aguilar-Valles
Department of Biochemistry &Goodman Cancer Research Centre, McGill University,Montreal,QC,H3A 1A3,Canada;Department of Neuroscience,Université de Montréal,Montreal,QC,H3C 3J7,Canada

Evdokia Anagnostou
Bloorview Research Institute,University of Toronto,Toronto, Ontario,Canada

Emma Ashwin
Autism Research Centre,Department of Psychiatry,University of Cambridge,UK

Bonnie Auyeung
Autism Research Centre,Department of Psychiatry,University of Cambridge,UK

Kelly M.Bakulski
Department of Epidemiology,Johns Hopkins Bloomberg School of PublicHealthand Wendy Klag CenterforAutismandDevelopmental Disabilities,Johns Hopkins BloombergSchoolof Public Health, Baltimore,MD21205;andCenterforExcellenceinGenomic Science,Johns Hopkins University,Baltimore,MD 21205,USA

Simon Baron-Cohen
Autism Research Centre,Department of Psychiatry,University of Cambridge,UK

Margaret L.Bauman
DepartmentofAnatomyandNeurobiology,Boston University School of Medicine,Boston,MA02118,USA

作者名录    11
Donna Betts
Art Therapy Program,The George Washington University, Alexandria,VA 22314,USA

Chad A.Bousman
Department of Psychiatry,The University of Melbourne,Parkville, Victoria,Australia

Daniel B.Campbell
Zilkha Neurogenetic Institute,University of SouthernCalifornia; Department of Psychiatry and the Behavioral Sciences,University of Southern California Keck School of Medicine,Los Angeles,CA 90089,USA

Manuel F.Casanova
DepartmentofPsychiatryandBehavioralSciences,Schoolof Medicine,University of Louisville,Louisville,KY 40202,USA

Bhismadev Chakrabarti
Autism Research Centre,Department of Psychiatry,University of Cambridge,UK;Centre for Integrative    Neuroscience and Neurodynamics,SchoolofPsychology and ClinicalLanguage Sciences,University of Reading,UK

Gursharan Chana
CentreforNeuralEngineering,VictoriaResearchLaboratory, National Information and Communications Technology Australia, Department of Electrical and Electronic Engineering,and Department of Psychiatry,The University of Melbourne,Parkville, Victoria,Australia

Abha Chauhan
NYSInstituteforBasic ResearchinDevelopmentalDisabilities, StatenIsland,NY 10314,USA

Ved Chauhan
NYS Institute for Basic Research in Developmental Disabilities, Staten Island,NY 10314,USA

12    作者名录

Jessica DeWitt
Program in Biological and BiomedicalSciences and the Zilkha Neurogenetic Institute,University of Southern California,Los Angeles,CA90089,USA

Keith W.Dunaway
Medical Microbiology and Immunology,Integrative Genetics and Genomics graduate group,M.IN.D.Institute,Genome Center, University of California at Davis,Sacramento,CA95817,USA

Alal Eran
Center for Biomedical Informatics and Department of Pediatrics, HarvardMedicalSchool,Boston,MA02115;Children'sHospital Informatics Program,Boston Children's Hospital,Boston,MA 02115,USA

Ian P.Everall
Department of Psychiatry,The University of Melbourne,Parkville, Victoria,Australia

M.DanieleFallin
Department of Epidemiology,Wendy Klag Center for Autism and Developmental Disabilities,Department of Biostatistics,and Department of Mental Health,Johns Hopkins Bloomberg School of PublicHealth,Baltimore,MD21205;Center for Excellence in Genomic Science,Johns Hopkins University,Baltimore,MD 21205,USA

Richard E.Frye
ArkansasChildren'sHospitalResearchInstitute,Departmentof Pediatrics,University of Arkansas for Medical Sciences,Little Rock AR72202,USA

Piers Gillett
Centre for NeuralEngineering,Victoria Research Laboratory,National Information and Communications Technology Australia,Department ofElectrical and Electronic Engineering,and Department of Psychiatry,The University of Melbourne,Parkville,Victoria,Australia

作者名录 13

Matthew Ginsberg
ClevelandClinicLernerCollegeof Medicine,ClevelandClinic, Cleveland,OH44195,USA

Christos G.Gkogkas
Department of Biochemistry &Goodman Cancer Research Centre, McGillUniversity,Montreal,QC,H3A1A3,Canada;Currentafflia- tion:Patrick Wild Centre and Centre for Integrative Physiology, University of Edinburgh,Hugh Robson Building,GeorgeSquare, EH89XD,Edinburgh,UK

Rhonda J.Greenhaw
Office of Collaborative Programs and Hussman Center for Adults with Autism,Towson UniversityCollegeof HealthProfessions, Towson,MD 21252,USA

Simon G.Gregory
Duke Molecular Physiology Institute,Duke University Medical Center,Durham,NC 27710,USA

Elena L.Grigorenko
Yale Child Study Center,Yale University,New Haven,CT 06520, USA;MoscowStateUniversityforPsychologyandPedagogy, Moscow,Russian Federation

Feng Gu
NYSInstituteforBasicResearchinDevelopmentalDisabilities, StatenIsland,NY10314,USA

Rebecca Harmer
Capital Region Children’s Center,Washington,DC 20006,USA

Martha Herbert
TRANSCEND Research Program,Massachusetts General Hospital; Harvard Medical School;Higher Synthesis Health,Boston,MA

14             作者名录

ValerieW.Hu
Department of Biochemistry and Molecular Medicine,The George Washington University School of Medicine and Health Sciences, Washington,DC 20037,USA

Karen L.Jones
Department of Rheumatology,Allergy,and Clinical Immunology, and the M.I.N.D.Institute,University of California,Davis, Sacramento,CA95817,USA

Petra Kern
Music Therapy Consulting,Santa Barbara,CA 93103,USA;
Marylhurst University,Portland,OR 97036,USA;University of Louisville,Louisville,KY 40202,USA

Arkady Khoutorsky
Department of Biochemistry &Goodman Cancer Research Centre, McGill    University,Montreal,QC,H3A1A3,Canada

Rebecca Knickmeyer
Autism Research Centre,Department of Psychiatry,University of Cambridge,UK;Department ofPsychiatry,University ofNorth Carolina-ChapelHill,ChapelHill,NC27599,USA;Neurosciences Hospital,ChapelHill,NC27514,USA

Isaac S.Kohane
Center for Biomedical Informatics and Department of Pediatrics, HarvardMedicalSchool,Boston,MA02115;Children'sHospital Informatics Program,Boston Children's Hospital,Boston,MA 02115,USA

Louis M.Kunkel
Division of Genetics and Genomics and the The Manton Center for Orphan Disease Research,Boston Children's Hospital,Boston,MA 02115;DepartmentofPediatricsandDepartmentofGenetics, Harvard MedicalSchool,Boston,MA02115,USA

作者名录    15

Janine M.LaSalle
Medical Microbiology and Immunology,Integrative Genetics and Genomics graduate group,M.I.N.D.Institute,Genome Center, University of California at Davis,Sacramento,CA95817,USA

Michael V.Lombardo
Autism Research Centre,Department of Psychiatry,University of Cambridge,UK
Deepali Mankad
Bloorview Research Institute,University of Toronto,Toronto, Ontario,Canada

Marvin Natowicz
ClevelandClinicLernerCollegeof Medicine,andPathology& Laboratory Medicine,Genomic Medicine,Neurological    and PediatricsInstitutes,ClevelandClinic,Cleveland,OH44195,USA

Laura Nicholls
School of Biotechnology and Biomolecular Sciences,University of New South Wales,Kensington,Sydney NSM 2052,Australia

Christos Pantelis
Department of Psychiatry and Melbourne Neuropsychiatry Centre, Department of Psychiatry,The University of Melbourne &Melbourne Health,Parkville,Victoria,Australia

Natalia Rakhlin
Yale Child Study Center,Yale University,New Haven,CT 06520, USA

Radhika Ramadas
School of Biotechnology and Biomolecular Sciences,University of New South Wales,Kensington,Sydney NSM 2052,Australia

DanielA.Rossignol
Rossignol MedicalCenter,Irvine,CA92618,USA

16             作者名录

Tewarit Sarachana
Department of Biochemistry and Molecular Medicine,The George Washington UniversitySchoolof MedicineandHealth Sciences,Washington,DC       20037,USA;Current       address: Department ofClinical Chemistry,Faculty of Allied Health Sciences,Chulalongkorn    University,Bangkok,Thailand

Stephen W.Scherer
Program in Genetics and Genome Biology,The Centre for Applied Genomics,The Hospital for Sick Children,Toronto,Ontario M5G 0A4Canada;McLaughlinCentre,Universityof Toronto,Toronto, Ontario M5S 1A1,Canada

Gabriela Schmulevich
Art Therapy Program,The George Washington University, Alexandria,VA 22314,USA

Ayten Shah
Children's Mercy Hospital,Kansas City,MO 64108,USA

Frank R.Sharp
Department of Neurology and the M.IN.D.Institute,University of CaliforniaatDavis,Sacramento,CA95817,USA

AlisonB.Singer
Department of Epidemiology and Wendy Klag Center for Autism and Developmental Disabilities,Johns Hopkins Bloomberg School of Public Health,Baltimore,MD 21205,USA

Efstratios Skafidas
CentreforNeuralEngineering,VictoriaResearchLaboratory, National Information and Communications Technology Australia, Dept.of Electrical and Electronic Engineering,and Department of Psychiatry,The University of Melbourne,Parkville,Victoria, Australia

EstateM.Sokhadze
Department ofPsychiatry and Behavioral Sciences,School of Medicine,UniversityofLouisville,Louisville,KY40202,USA

Nahum Sonenberg
Department of Biochemistry &Goodman Cancer Research Centre, McGill    University,Montreal,QC,H3A1A3,Canada

Boryana Stamova
Department ofNeurology and the M.IN.D.Institute,University of California at Davis,Sacramento,CA95817,USA

Zohreh Talebizadeh
Children'sMercyHospital,KansasCity,MO64108;Universityof Missouri-Kansas City School of Medicine,Kansas City,MO 64108,USA

Renee Testa
Melbourne NeuropsychiatryCentre,Departmentof Psychiatry,The UniversityofMelbourne&MelbourneHealth,Parkville,Victoria, Australia;DepartmentofPsychology,Monash University,Clayton, Victoria,Australia

Judy Van de Water
DepartmentofRheumatology,Allergy,andClinicalImmunology, and the    M.I.N.D.Institute,University    of    California,Davis, Sacramento,CA95817,USA

Irina Voineagu
School of Biotechnology and Biomolecular Sciences,University of NewSouthWales,Kensington,SydneyNSM2052,Australia

Daniel Williams
Centre for Neural Engineering and Department of Psychiatry,The University of Melbourne,Parkville,Victoria,Australia

18    作者名录

Ryan K.C.Yuen
McLaughlin Centre and The Centre for Applied Genomics,Hospital forSickChildrenand Universityof Toronto,Peter GilganCentre forResearchandLearning,Toronto,OntarioM5S1A1,Canada

Daniela Zantomio
Department    of    Haematology,Austin    Health,Heidelberg,Victoria, Australia

目录

剖析 ASD 的遗传结构 1
第 1 章表型的鉴定：自闭症研究，诊断和治疗的里程碑 3
第 2 章从分子通路到ASD治疗：来自综合征类自闭症的领悟 17
第 3 章自闭症谱系疾患的语言障碍 35
第 4 章自闭症的全基因组测序：临床转化 49
第 5 章整合性非常规数据分析方法对自闭症遗传学研究的影响 68
第 6 章使用基因通路分析构建ASD的遗传分类 81

自闭症的异常基因调控：从转录到翻译 99
第 7 章自闭症血液和淋巴母细胞泛基因组表达的研究 101
第 8 章在“黑暗”中搜索：非编码RNA 作为新的自闭症研究领域 121
第 9 章针对非编码RNA 治疗自闭症谱系障碍 141
第10章自闭症中的A-to-I RNA编辑 161
第11章自闭症和脆性X 综合征的翻译控制 177

表观遗传的，环境的和生理的因素对自闭症的影响 199
第12章自闭症的表观遗传学 201
第13章自闭症的表观遗传学——超越碱基的传递 219
第14章自闭症谱系障碍的基因与环境因素：一个整合的视角 242
第15章代际传递的甲基化和基因组的环境因素可能造成的
“脑力流失” 271
第16章自闭症谱系障碍的氧化应激和线粒体功能障碍 295
第17章自闭症谱系障碍中的母源自身抗体 311
第18章为什么自闭症在男性较为普遍? 326

ASD 的个性化治疗和一生不同阶段的议题 343
第 1 9 章自闭症谱系障碍的精神药理学的未来导向 345
第20章自闭症的共病——潜在的生物学机制和/或亚型诊断的
线索 362
第21章全身方法对自闭症脑部健康转化的影响：新陈代谢和

20       目录

电生理之间转导的神经可塑性机制 374
第22章争取自闭症的最佳疗效：治疗自闭症中或许可被逆转的
情况 404
第23章经颅磁刺激在自闭症中的应用 424
第24章音乐治疗：对自闭症谱系障碍患者的个性化干预 441
第25章美术治疗在自闭症谱系障碍患者治疗、评估及研究中的
作用 454
第26章范式转换：我们对成人自闭症的理解 474

剖析 ASD 的遗传结构

第1章

表型的鉴定：自闭症研究，诊断和治疗的里程碑

Valerie W.Hu
王一迪译，刘君孔学君校

摘要
自闭症谱系障碍(ASD) 是指一组神经发育障碍，影响一个人从事社会互动和沟通的能力，并且经常与刻板的重复行为以及狭窄的兴趣相关联。个体表现出ASD 主要症状的可变程度导致相当大的临床异质性，且通常归因于包括代谢紊乱以及基因-环境相互作用的遗传和生物异质性。这种异质性对所有视自闭症谱系上的不同个体为单一病例组与正常对照组比较的研究提出了极大挑战。在本章中我将回顾用于降低特定研究组中的个体之间的异质性的表型鉴定方面的研究，以提高检测遗传变异体和基因表达特征以及与ASD 亚型相关的生物标志物的能力。
关键词：自闭症谱系障碍；异质性；亚型；分类；多方面分析；基因表达；基因；生物标记物；亚型特定治疗靶标。

前言

自闭症谱系障碍(ASD) 是指由一组症状所界定的具有高度可遗传的神经发育综合征，根据在《精神疾患诊断和统计手册》(DiagnosticandStatisticalManual of Mental Disorders)第5版1中公布的最新临床诊断标准的症状特征为：①“多种语境的社会交往和社会互动的持续障碍”以及②“狭窄、重复的行为、兴趣或活动模式”。在这两个广泛定义的功能和行为领域中有很多种症状，并可包括或不包括不同程度上的语言产生和使用的困难、未能理解或使用非语言交流(即手势)、难以应对各种感官刺激，自我伤害、攻击、异常步态、肌

4          剖析 ASD的遗传结构

张力低下和其他生理症状，例如过度换气和昏厥。有意义的是，ASD 个体在学者技能“savant skills”,即指在特定领域(例如艺术、音乐、记忆或计算技能)的能力表现远远高于正常人群，其频率估计比正常人高出10倍。简言之，ASD 一词描述了一个高度异质性综合征，其对寻求建立该疾病的遗传或分子“原因”的遗传学家和生物学家提出了重大挑战。
尽管已鉴定出与ASD在不同程度上相关的一些综合征的特定基因，如脆性X 染色体综合征、Rett 综合征和结节性硬化2,但目前既没有明确的遗传标记，也没有某个分子能明确用于诊断“特发性”(原因不明)ASD,其低于20% 的 ASD 存在遗传变异。目前开展临床试验研究针对已知基因组成的特发性 ASD开发有效的药物，如针对脆性X³, 但现在还没有明确针对特发性ASD 或 ASD的核心症状开发出特效疗法。为了增加我们对 ASD的发病机理和生物学的理解，以及促进在诊断和治疗多数ASD 患者方面的进展，我们必须将表型的鉴别纳入 ASD 的遗传和其他生物分析4。本章中将回顾如何把特发性 ASD的个体分为表型亚组(或亚表型),以及描述如何使用这种方法来鉴别亚型相关的新的治疗靶位的生物学表型及其显示用于诊断 ASD的亚型特异性生物标志物的潜力。

异质性：ASD 分层的分类和维度方法

Leo Kanner的第一份报告5在1943年描述了11个自闭症个体的行为和临床异质性，他不仅从这些病例中提出了术语“自闭症障碍”,而且提供这些“病症”的特点区别于这些与他以前在诊所看到的所有病例。这些“自闭症” 的特征包括：①在一般情况下无法与他人交往，被描述为“极端自闭性孤独”;②使用语言困难；③表达和接受语言刻板；④卓越的机械记忆力；⑤强烈希望不受干扰；⑥反感任何形式的打扰，包括感官的；⑦强迫性的、一成不变的需求，和⑧局限或缺乏自发性。自从对“自闭症”的第一次描述和由于早期孪生和家庭研究揭示自闭症的遗传性。然而，除了少数例外，这些研究大多数未能复制早期或在不同队列的研究结果。复制遗传研究结果的失败主要归因于ASD 群体的异质性，其中最近的全外显子测序证明了比先前想象得更加异质，估计目前自闭症候选基因的数量(基于稀有基因变体)已达到数百个。包括DNA的非编码区以及蛋白质编码区的全基因组测序虽对于稀有基因变异比外显子测序提供数量级更多的信息，但进一步增加了ASD的遗传学复杂性16]。近来才开始努力开展为减少ASD的异质性而进行的遗传分析。
两种常用的策略已用来探讨减低遗传性ASD 病例的异质性：一种是根据

第1章表型的鉴定：自闭症研究，诊断和治疗的里程碑    5

行为如学者技能、强迫、重复行为或障碍过程(例如，退化与早期发作无退化) 将先证者分类成亚组,而另一种是根据特定症状或数量特征(例如，语言和非语言能力和社会反应能力)的维度分层，对严重性可以进行评分19.21-23】。这两种策略已被证明可用于增加检测可能被遗漏的遗传变异的灵敏度。多维分层还使具有内在表型(或性状)但是没有临床表现243的非自闭症亲属包含在内，尤其是在连锁分析中将增加将遗传变异与特定性状相关联的能力。这种研究设计最近在拓展的谱系分析中，广泛用于检查与自闭症表型(BAP) 相关的遗传基因位点，其主要针对个性特征和语用语言缺陷。这项研究的结果支持将内在表型纳入遗传分析，从而可以揭示先前未检测到的，与BAP的不同组成部分(例如重复/仪式行为、社会功能、语用语言和焦虑)的连锁区域。尽管在后来的研究中，另一语言相关基因位点13q 也被发现与焦虑和社会交际相关，但在本研究中，未能复制在先证者和其未确诊的父母27的以前研究中显示与语言表型(即7q) 连锁的基因位点。另一个最近的关联研究28包括所有家庭成员的语言和行为表型在分析中确定了两个新的语言表型的基因位点15q23-26 和16p12、两个新的社会行为的基因位点14q 和15q 和另一个在13q 处的重复行为的基因位点，其不同于来自Piven 等人研究的重复行为基因位点(6p 和19p)²5 。单独连锁分析虽然为ASD和与ASD相关的内在表型的家族性和遗传结构提供信息，但未能促进了解BAP或 ASD的分子途径。

ASD 表型合并于转录组分析

为了更好地了解作为ASD 病理生物学基础的特定基因和代谢/信号通路，我们进行了一系列基因组全基因表达(即转录组)分析研究，首先从与ASD 诊断不一致的单卵双胞胎开始,然后配对受影响和未受影响的兄弟姐妹301, 最后对比与ASD 无亲戚关系的个体与年龄和性别配对的未受ASD 影响的正常对照3。在使用双胞胎或兄弟姐妹的实验设计，利用相同或相似的基因型来减少遗传异质性时，我们认为有必要将无亲戚关系的个体分组到更相似的表型亚组以减少案例研究的临床异质性(其部分原因可能是由于遗传异质性)。为了实现这一点，我们开发了一种基于来自自闭症诊断访谈量表修订本(ADI-R) 。ADI-R 诊断的另一个优点是关于ASD个体所表现的多种症状和功能缺陷的严重程度的定量数据的实用性，其允许表型亚组分析和

6    剖析 ASD 的遗传结构

数量性状分析，如将在后面谈到的来自全基因组关联研究(GWAS)的预先存在的基因型数据的荟萃分析。
总而言之，使用了在63个项目上(几乎所有受ASD 影响的功能域)的123 个严重性评分进行多元聚类分析(层次聚类、主成分分析和K 均值聚类分析),以较高评分数反映相同项目上的“当前”和“过去”评分32]。这些包括口语和非语言的交流、社交和娱乐技能、刻板、重复性和仪式性行为、狭窄的兴趣、自我伤害和侵略性行为、身体敏感性以及学者(savant) 技能。通过将所有这些行为纳入我们的亚组分析中，我们希望识别个体的亚组，其反映构成ASD 的症状程度(只是有不同程度的严重性),而不是专注于如口头语言等单个领域。这种亚表型分类策略的初步结果应用于来自1351名ASD患者的ADI-R 评分，如图1-1所示。通过检查与亚组内最高严重性评分相关的项目，我们确定了四个亚组，区分为：①严重语言障碍(口语);②较高频率的学者技能，但在其他项目则中等严重程度；③轻度严重性，反映在对大量项目的得分为0分 (即正常);和④中等严重程度，但没有严重的语言障碍或明显的学者技能。我们接下来对来自四个亚组中的三个亚组的26～31位个体的LCL 进行了表达谱

(A)

(B)

图1-1 ADI-R评分的聚类分析结果。(A)主成分分析(PCA) 。图中的每个点表示个体，其在图上的位置由来自ADI-R诊断仪器的123个项目评分确定。分配给个体的颜色反映了分配给由K均值聚类分析产生的不同表型亚组的颜色[见图1-1(B)] 。 (B)K- 均值聚类分析，K=4 。个体由集群中的行表示，而ADI-R项由列表示。红颜色的强度反映了特定项目的严重程度(从1到3),而黑色表示0(“正常”评分)。数据来自Hu 等人30,基于由Hu 和Steinberg³²描述的ADI-R评分的聚类分析

L和M的交叠头的大小
炎症
胚胎发育
突触传导
(A)                                              神经元迁移记忆/学习细胞凋亡

语言 3900

199
20

语言亚型特异性昼夜节律
癫痫
细胞死亡(大数量基因)
对于正常刺激的疼痛反应对于疼痛刺激的过敏

3个亚型共有的
新生的无编码基因许多对男性激素有反应(调节?)

274                   9                   57
轻度       学者专长

(B)
图1-2 3 个 ASD 亚表组和对照组的基因表达谱的结果。基因表达热图(A)上面的彩色条指示 ASD 个人的小组和对照组。行：基因；列：个人。绿色：表达降低，相对于通用人 RNA 标准；红色：表达增加。(B)ASD 的三种亚型与对照组的差异表达基因数目以及它们的相关功能的维恩图。图片来自Hu 等[3,有改编

8          剖析 ASD 的遗传结构

分析，并将表达数据与来自29个对照的LCL的表达数据进行比较31]。图1-2 (A) 显示三个亚组与对照组比较基因表达中存在定性和定量差异，而图1-2 (B) 显示所研究的三个亚组每组中都具有与不同功能相关特有的差异表达基因(与对照组比较),但也具有一些重叠基因，值得注意的是一组由所有三个亚组共享的20个未知功能的长非编码转录。这些表达差异对亚组特异性治疗方法的意义将在后面讨论。

用于生物标志物鉴定相关亚型预测分析

我们对来源于外周组织(即血液)细胞的基因表达研究的目标之一是鉴定可用于诊断筛查的生物标志物差异表达基因的特征。因此，在上述研究中鉴定的亚组相关表达谱的基础上，我们进行了分类预测分析以鉴定可以区分病例与对照组最稳定的差异表达基因34]。这些研究鉴定了18～29个能够区分对照与分配到不同表型亚组病例的亚组相关性基因(转录物),准确性大于93%(表1-1)。重要的是，每组亚组特异性基因的敏感和特异性也大于90%。有意义的是，即使把所有病例都合并到一个病例组中时，病例仍然可以与对照组分开，但只有约81%的准确度，91%的敏感性和61%的特异性。使用定量核酸酶保护分析(qNPA),我们也证实了来自语言亚组的一个基因子集(29个基因中的14个)有能力将22个初始病例从22个最初对照组中分离，有78%的敏感性和80%的特异性。我们进一步扩大在新队列的病例组与对照组，验证这组基因达到了约90%的敏感性，但只有75%的特异性。尽管需要扩大验证组的数量和优化与原发性外周组织一起使用的生物标记物筛查的基因选择，我们的研究显示了利用基因表达特征来诊断ASD的潜力，并进一步证明了将亚型并入分类预测分析中可以增高敏感性和特异性这一事实。
表1-1 分类预测分析的结果，其确定了能够以相当高水平的准确性、灵敏度和特异性区分病例和对照的转录物(基因)34]。很明显，所有三亚型的表型定义改善了类别预测参数。L: 语言受损亚型；M: 轻度严重；S: 学者专长；A: 全部(组合情况);C: 对照组

病例对照准确率(%)(基因数) 灵敏度(%) 特异性(%)
L vs C 93.3    (29) 96.6 90.3
Mvs C 94.5    (26) 96.0 93.3
S vs C 94.0    (18) 96.6 90.5
A vs C 81.8    (74) 91.2 61.1

第1章表型的鉴定：自闭症研究，诊断和治疗的里程碑    9

ADI-R 衍生的表型亚组在遗传分析中的价值

为了检验基于ADI-R聚类分析的表型亚组策略是否可以提高从全基因组关联分析(GWA) 鉴定ASD相关的常见单核苷酸多态性(SNP) 的能力，我们用已经发表的GWA研究³6的基因型数据进行了荟萃分析³51,其数据包括来自 4000个ASD患者和超过7000个对照组个体的超过550000个SNP。然而，因为我们只能获得包括以前研究中的仅1867个患者的ADI-R分析表(对于我们的分析所必需的),我们将我们的分析限于这些病例，也包括来自前面研究的 2438个对照组个体。然后，ADI-R 数据以两种方式使用：①通过对特定性状的项目(包括口语、非语言通信、游戏技能、社会发展和坚持同一性等)的评分求和来产生案例组的数量性状分布概况；②通过123个ADI-R 评分的聚类分析以多项评分构成了每个个体的每个性状，将ASD患者分为表型亚组32]。我们对先前存在的GWA 数据的荟萃分析是在3个阶段完成的。第一阶段涉及性状相关的定量分析，选择认为与五种性状中的任何一种相关(P<10-⁻⁵)的 SNP, 假定这些性状更可能与功能相关，而将其SNP 的总数减少到167个特有的 SNP。研究的第二阶段涉及对于每组性状相关SNP的亚型依赖性病例-对照相关分析，而第三阶段涉及病例-对照相关分析，其中使用了四种亚型作为独立病例组的亚型依赖性性状相关SNP(Bonferroni 法检验差异显著)的组合，以及1867位个体的组合。这个多阶段使用预先存在的基因型数据的数量性状位点(QTL) 亚表型关联分析鉴定出18个新型和高度显著的单核苷酸多态性的结果35。在这些SNP 中，10个在亚型之间共享，但具有相对于对照组明显不同的比值比(即，在一个亚型中倾向，在另一亚型中具有保护性), 证实了亚型之间这些基因位点的遗传异质性。值得注意的是，当将所有 ASD个体组合成一个病例组时，没有鉴定到显著的SNP, 因此证明是异质性减少，而不仅仅是个体数目的增加导致遗传分析中的功效增加。有趣的是，所有的SNP 都位于ASD相关的功能途径基因的非编码区域中，或在先前与 ASD 相关的CNV区域371。功能途径包括轴突生成、神经生成、长期突触增强和类固醇代谢，后者我们也已经通过来自同胞对的LCL的基因表达谱予以确定。
应该提及的是，将这种表型亚群方法应用于ASD 家系的遗传连锁分析以及结合新的分层以消除家族内异质性使LOD 评分有了显著改善，这一点在 Talebizadeh 和 Shah 的第5章中有所讨论。如下一节所述，GWAS数据的荟萃分析涉及的一些基因，以及通过亚型相关性基因表达谱所揭示的一些基因，提示了用于治疗以及可能的药物基因组学应用的新靶标。

10          剖析 ASD 的遗传结构

靶向治疗和药物基因组学中表型鉴定的价值

如前所述，一些亚表型相关差异表达的基因可能表明亚组特异性治疗的新方法。例如，仅因在严重语言障碍的ASD 亚组中差异表达的15个昼夜节律相关基因中，有2个基因，即AA-NAT和 DPYD,其缺乏症基因提示新的治疗方法。因为AA-NAT是褪黑激素(内源性睡眠诱导激素)生物合成中的限速酶，这种酶(或褪黑素)在特定个体中的缺陷可表明褪黑激素补充不仅可以改善在具有严重语言障碍的个体中经常出现的睡眠障碍，而且因为昼夜节律与突触调节的相关性39],可能也会改善神经功能。的确，最近关于使用褪黑激素于 ASD相关睡眠障碍的文献综述表明，向ASD患者提供褪黑激素补充产生睡眠参数(持续时间、发作延迟和更少的夜间觉醒)的改善，同时还有一些白天行为改善的迹象。
另一方面，二氢嘧啶脱氢酶(DPYD) 是参与(来自DNA)核酸分解的酶，其导致β-丙氨酸的产生。β-丙氨酸(一种氨基酸)已经显示为在各激动剂结合位点结合GABA 和甘氨酸的受体的抑制性神经递质，导致抑制性神经传递。因此，由于DPYD 缺乏导致的该神经递质的减少预期导致在突触处减少的抑制性信号传导，其已被假定为引起 ASD 的神经病理学的中心成分。有趣的是，DPYD 缺乏与癫痫、精神和运动障碍以及ASD有强烈相关。因此，一种治疗具有这种酶缺乏的ASD 个体的新方法可能是使用β-丙氨酸 (大脑可以利用的一种营养补充剂)来抵消缺陷。由于β-丙氨酸也被假定为“内源性抗抽搐分子”,它也可用于治疗癫痫(在相当大部分ASD个体中的共发病),正如 Weaver 和同事所建议的，尽管不是没有种族依赖性不良反应。从药物基因组学的角度来看，一个呈现DPYD缺陷的ASD个体也可能是抗惊厥药物的良好候选人，这些药物已在缺乏生物学原理的情况下，通过反复试验用于ASD。
类似地，从亚型依赖性遗传分析生成的生物学观点也可以告知药物基因组学和靶向治疗。作为实例，我们发现HTR4(一种血清素受体)内含子中的两个 SNP 与 ASD的严重语言表型高度相关35,我们还发现其表型HTR4的表达降低3¹]。有趣的是，肠道中的HTR4 缺乏与消化系统疾病相关4⁶],而消化系统疾病也常常在患有ASD的个体中观察到，特别是在更严重受影响的个体中，可能与昼夜节律功能障碍有关。由我们的亚型相关性关联研究牵涉的两种趋化因子基因(CCL20 和 CCL25)也与肠道疾病相关47〕,因此作为治疗同时患有肠道病症的ASD个体的一种靶位。事实上，与ASD 相关的MET 癌基因中遗传变异的最初发现是基于具有ASD 和肠道疾病的个体亚群的遗传分析。

第 1 章表型的鉴定：自闭症研究，诊断和治疗的里程碑    1 1

正如Herbert 在第21章中所讨论的，对ASD的治疗采取全身方法对神经功能也有显著的影响。

未来方向

在前面的章节中，我总结了我们实验室的一些研究，利用ADI-R 评分的亚群分析对ASD 病例进行分组以及基因表达，遗传学和类别预测的分析，其共同证明异质性降低的价值以更好地将行为表型和潜在生物标志物与生物学表型 (由不同的基因表达签名所呈现)相关联，并增加GWAS 中的信噪比。由于最新的基因组技术现在提供了对整个人类基因组进行测序的能力，(Yuen 和Scherer的第4章),使用表型定义从拥有大量“噪声”(因为收集的数据的绝对量级)的大规模研究中提取具有生物学意义的信息变得更加重要。相同的情况也适用于表观基因组和其他“组学(omes)”(例如代谢组微生物组)的全基因组研究，以及临床试验，因为显然没有单一的药物/治疗对于所有ASD个体都是有效的。实际上，有许多方法实现异质性的减少，其可能促进ASD的特定表型与来自常规的遗传/生物学差异的关联，以及阐明可能助于引起ASD 的特定亚型的基因，途径和致病机制。实际上，有许多方法实现异质性的减少，其可能促进ASD的特定表型与来自规范的遗传/生物学差异的关联，以阐明可能促成了某种特定ASD 亚型的基因，途径和致病机制。除了之前提到的使用基本行为表型(例如语言，非语言交流或社交响应性的缺陷，以及存在的学者技能或重复性行为)来减少遗传分析的异质性，还可能可以通过代谢分析而获得 (Frye 和 Rossignol的第22章)、线粒体功能障碍的关联(Gu 等人的第16章)、母体自身抗体的存在和/或性质(Jones和 Vande Water的第17章)、合并症 (Bauman 的第20章)或合并聚类[49、语言障碍程度(Rakhlin和 Grigorenko的第3章)、功能磁共振成像(fMRI)[50、主要致病成分的聚类分析5¹,甚至良好记录的环境暴露(Bakulski 等人的第14章)得到额外的信息表型。
除了提供对于许多促进ASD 的发病机制和病理生理学因素更好的理解，这种“分而治之”的方法对克服ASD异质性的预期转化结果是：①发展亚型相关性诊断生物标志物，可以更好地告知关于ASD的药物基因组学，和②亚型特异性基因或分子靶标的鉴定，其可以基于适当的生物学原理引起针对ASD患者特定亚组的新的治疗选择的发展，从而把 ASD 的治疗推向ASD 个体化医疗。

本章要点

● ASD的异质性对旨在鉴定自闭症的潜在遗传和/或分子基础的研究提出了

12          剖析 ASD的遗传结构

重大挑战。
●根据行为症状、共病或代谢和免疫异常的差异将ASD 的个体分为不同的亚组，可以预见这有助于甄别各亚组不同的致病机制。
●未来，必须更加注意表型在ASD 研究中的定义，以利用大规模“生物组化” 技术的力量，揭示亚组特异性基因以及代谢和信号通路，可提供诊断和治疗的新目标。

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第 2 章

从分子通路到 ASD 治疗：来自综合征类自闭症的领悟

Laura Nicholls,Radhika Ramadas,Irina Voineagu 王一迪译，刘君孔学君校

摘要
自闭症谱系障碍(ASD) 虽有高度遗传性，但在遗传和临床上具有高度异质性。目前，ASD 治疗依赖于早期行为干预，虽部分有效但不是治愈性的，并且至今还没有对ASD 特异的药物治疗。 ASD的综合征形式具有自闭症症状的高发病率，其为理解 ASD的神经生物学机制提供了独特的机会。在这里，我们讨论目前在脆弱X 综合征、Rett 综合征和结节性硬化的分子和神经生物学机制方面的进展，以及为这些被认为是ASD 的综合征形式所开发的新疗法。我们将进一步探查最近支持综合征性和特发性 ASD 具有共同机制的证据，并讨论使用为综合征性ASD开发的药物来有效治疗特发性ASD的可能性。
关键词：Rett 综合征；脆性X 综合征；结节性硬化；综合征类自闭症；自闭症遗传学。

前言

自闭症谱系障碍(ASD) 是一组神经发育疾患，可定义三个核心领域的不同程度缺陷：语言、社会互动和重复性行为。该疾病的临床和遗传景观有高度异质性：每个ASD病例在行为和认知维度上的损伤严重程度都不同，并且尽管具有强大的遗传性病因，已知的遗传原因占所有病例的不到20%,其中由单个原因引起的不超过2%。
根据精神障碍的诊断和统计手册(DSM-IV)²],ASD 包括自闭症、Asperger 综合征和广泛性发育障碍(PDD-NOS) 。在频谱最严重的末端，自闭症需要三

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个核心领域的缺陷以及在3岁之前发病。 Asperger 综合征定义为社会沟通障碍、狭窄性重复行为但语言正常症；而PDD-NOS定义需要在至少一个核心领域中具有缺陷以及排除自闭症、Asperger综合征或其他普遍性发育障碍的诊断。此外，ASD与其他临床功能障碍例如运动和感觉异常³,4],癫痫5和智力残障有显著的共存，特别是在自闭症障碍的患者中6。
像许多精神疾病一样，ASD 的诊断和分类具有重大的挑战性，因为依赖于观察行为和认知功能，而没有生物标志物的验证。由于存在固有的诊断歧义，尽管在症状如何分类方面存在显著的一致性，临床医生之间在把个体归类为自闭症、Asperger综合征或PDD-NOS亚型时会存在差异7,8]。此外，只有非常少量的研究有发现亚型之间的差异9-11以及已证明ASD类别的归类是预测临床结果的不良因子12-13。有人认为，最近发现的ASD 病例的增加,其部分原因是不完善的诊断标准。在DSM-IV 实施时，自闭症当时被认为是一种罕见的疾病，只影响0.1%的人口¹5],而ASD的患病率现在已上升到约1.1%,且增幅在很大程度上归因于诊断标准的演变包含了更广泛的ASD概念和一般人群中也有了更高的就诊意识16]。但也不能排除遗传和环境因素所造成的增加(请参阅参考文献)。
由于这些诊断敏感性和特异性的问题，在最新版本的DSM(DSM-V) 中， ASD的分类结构进行了大幅度修订。根据DSM-V的标准，ASD 将成为一个单一诊断(没有现有亚型),基于在社交沟通和狭窄/重复行为这两个核心领域中的受损。为满足ASD诊断的标准，所有社交缺陷以及至少两个重复的局限性行为、兴趣或活动必须在年幼时表现出来。虽声明这种更多维度的ASD诊断方法可以保持ASD 诊断的完整性，并且允许基于更有意义区别的子类型化 (参见参考文献),所有DSM-V 标准实施后的效应仍有待评估。
目前，ASD 唯一有效的治疗是早期行为干预19,旨在提高语言能力、沟通技巧和减轻重复行为和自我伤害行为。用于ASD的药物治疗是完全非特异性的，包括抗精神病药、抗抑郁药和抗焦虑药等，有效性都较低[20。另一方面，特定药物疗法的发展完全取决于对 ASD 基础分子机制的阐明。
我们当前对自闭症分子基础的理解来源于大量自闭症遗传学的研究。虽然 ASD的临床异质性反映了同样复杂的遗传异质性[21,几种罕见的单基因综合征显示出高自闭症症状的外显率。超过20%的脆性X 综合征、Rett 综合征和结节性硬化症患者符合 ASD 诊断标准↓。这些ASD 的综合征形式对于展开分子机制的研究以及动物模型和靶向药物筛选可以提供特有的资料。因此，对于ASD 综合征形式的靶向治疗进展更快，其中一些治疗方法已经在进行临床试验[22。
在本章中，我们将讨论近来从这些ASD 综合征形式所了解的ASD分子基

第2章从分子通路到ASD治疗：来自综合征类自闭症的领悟    19
础，并讨论是否收敛路径可能导致综合征形式和特发性的ASD,以收敛路径用于开发有效治疗的可能性作为重点来讨论。

特发性 ASD的遗传学

虽然ASD 最初被认为是一种心理疾病，归因于冷漠的教养方式。如果在兄弟姐妹之间患ASD的是男性，兄弟姐妹的发病风险为3倍，而女性外显率较低，其论据可信。如果在兄弟姐妹之间有一个以上ASD患者，兄弟姐妹的发病风险则为2倍。我们观察到 ASD病患的未受影响家族成员通常具有轻度自闭症样表型，这进一步证实ASD 的遗传负荷作用28]。这种现象在多个成员患病的家庭中最显著,这说明由于新生突变而导致病症的可能性较小。
由于自闭症的高遗传性，大量的研究试图鉴别影响ASD 风险的遗传因素。在这里，我们简要概述目前对于特发性ASD 遗传因素的理解(综述见于参考文献)。
常见遗传变异

常见遗传变异对ASD风险的贡献已经通过近年几个大规模全基因组关联研究(GWAS)得到评估³]。Wang 等鉴定了6个具有全基因组意义(P<5× 10⁻⁸)的 SNP, 在染色体5p14 上，CDH9和 CDH10之间32¹。进一步的研究显示这些与ASD 相关的SNP 是被膜突蛋白假基因反义的非编码转录物的一部分33】。第二个GWAS鉴定了一个ASD 相关的SNP 在于MACROD2的内含子中³]。第三个GWAS来自Weiss 等人鉴定出与ASD相关的一个SNP, 位于染色体5p15,SEMASA 和 TAS2R1之间34]。值得注意的是，每个GWAS未能复制他人的结果，这表明常见的遗传变异影响ASD 风险的效应值太小，以致在目前队列范围中无法检验(通常少于2000个ASD病例)。但如上述GWAS数据最近的荟萃分析已证明其非常小效应值的常见遗传变异造成的ASD 遗传率占到 40%～60%。
因此，目前认为每个患有特发性ASD的患者携带组合的效应值非常小的常见遗传变异和效应值非常大的罕见遗传变异，但没有一种是必需的或足以引起疾病的36]。
罕见遗传变异
染色体结构的异常是与 ASD相关的第一种罕见突变，其染色体重排在约

20       剖析ASD的遗传结构

6%～7%的ASD病例中可见1。与天使综合征相关的15q11 至15q13 区域中的母体遗传重复尤其常见，发生在1%～2%的ASD病例中↓。虽然在所有染色体中已经观察到涉及ASD的大型结构性畸变，但其因果关系很难确定³7。罕见变异在ASD 风险中的作用最近通过大规模拷贝数变异(CNV) 分析和外显子测序被有效地探索，其中外显子是基因组的蛋白质编码区。基于微阵列对于与ASD相关的CNV的调查已发现了几个经常性的主题。首先，每个研究都证实，遗传变异CNV 在对照组是同样常见的。第二，在先证者中检测到的重排CNV 普遍比对照组高出3%～5%[38-43】。第三，在先证者中检测到的 CNV 倾向于更大并且包含更多的基因38-43】。CNV 数据的网络和富集分析发现 ASD相关的CNV汇聚在泛素化和神经元细胞黏附通路44,以及突触形成和轴突导向[45。
下一代测序有助于更深入地研究自闭症中罕见的新生突变，特别是在最近四个研究中进行的大规模测序和分析ASD父母-儿童三联体的外显子。值得注意的是，后一项研究还显示了几个受罕见突变影响的基因与脆性X 智力迟钝蛋白的关联。因此，除了强调预测能改变ASD 蛋白质结构的罕见变异的频率增加之外，以上的研究进一步支持这些突变融合在神经可塑性的调节通路中。

综合征形式的 ASD

尽管目前丰富的知识启示了我们对 ASD 遗传病因的认识，大多数ASD 病例仍然没有确定的原因↓。自闭症的单基因综合征形式：如Rett 综合征、脆性 X 综合征和结节性硬化症提供了阐明ASD 基本生物学的一个独特的机会。例如，基因表达可以在①突变携带者和对照之间进行对比，以阐明突变特异性特征；②具有和不具有ASD的突变携带者，以确定ASD 特异性特征；③来自不同综合征背景的ASD病例，以鉴定ASD 共有的特征1。因此，对于ASD的综合征的研究提供了一个用于确定整个谱系中任何主要的分子病理学的高效简洁的方法。
Rett综合征
Rett 综合征(RTT) 是一种具有高度ASD外显率的X 连锁神经发育障碍，主要影响女孩，活产儿的发病率是万分之一。在6～18个月的正常发育后，

第2章从分子通路到ASD 治疗：来自综合征类自闭症的领悟 21

RTT儿童逐渐失去语言和有目的的手部使用，并发展为小头畸形、癫痫、共济失调、智力障碍和重复刻板行为，其50%也表现为自闭症51]。运动恶化发生在青少年后期，其特征为脊柱侧弯，显著的肌张力障碍，和偶尔失去行走能力。大于95%的典型RTT 是由MECP2中的新生突变引起的，MECP2 编码转录调节甲基化CpG 结合域蛋白250.53。尽管脑区受损程度不一样，神经病理学研究已经记录了 RTT 儿童患者脑部严重受损的突触形成和减少的树突分枝54,5]
MeCP2 属于甲基-CpG 结合结构域(MBD) 蛋白家族。虽然MBD 域结合对称的甲基化CpG 位点。MeCP2 在中枢神经系统中大量表达，有着转录激活剂以及抑制的作用。然而，编码人类大脑全基因组中MeCP2 的目标基因十分困难，因此许多关于MeCP2活动的知识仍然基于敲除或转基因MeCP2小鼠模型的研究【60]。其中一项主要研究鉴定了约400个受到MeCP2 抑制的基因和另外2000个看起来是由MeCP2活化的基因611。许多MeCP2 调节的基因参与神经突生长和所涉及突触，例如A2BP1, 它调节神经元基因的剪接，并且之前已经与自闭症易感性相关联。一些小的，基于阵列的研究调查了RTT 病例和对照组大脑之间的转录变异，并发现RTT大脑显示突触前，神经元特异性和神经发育基因的相对下调，以及和神经胶质特异性基因和通常参与神经变性的基因的上调63。
脆性X 综合征
脆性X 综合征(FXS) 是智力残疾中最常见的遗传形式，也是自闭症的主要原因之一，大约21%诊断为FXS的儿童随后被诊断为ASD⁶4] 。FXS起因于由于扩增的CGG重复或较不常见地来自错义突变导致脆性X 智力迟钝蛋白 (FMRP, 由 FMRI 编码)的沉默【65-67]。FMRP 是 RNA 结合蛋白，其通过三个 RNA 结合结构域中的任一个与主要的突触mRNA结合,并似乎通过与核糖体结合来抑制翻译，阻断起始和延伸。FMRP 在树突小棘中大大富集，并已显示调节几个突触家庭和其他自闭症相关的蛋白质71]。因此，FMRP的功能丧失被认为会引起对突触功能和可塑性的下游效应72]。
重叠在X 染色体上的一脆性位点FMR1由17个外显子组成，需要进行大量的可变剪接，并且在5'非翻译区中具有可变长度的 CGG 重复【73]。基于 CGG 重复长度，FMR1等位基因可以分为：正常、中间过渡期、预突变和完全突变。正常FMRI 等位基因含有5～44个重复，最常见的是29或30。中间等位基因携带45～54个重复，虽不稳定但不是致病的74]。预突变等位基因携带

22       剖析ASD的遗传结构

54和200个重复，减数分裂不稳定，特别是当母亲传播时。完全突变或具有大于200个重复等位的基因总是来源于母本传递的前期突变，并且扩增至完全突变的风险与母本前突变的长度成正比75]。扩展成完全突变引起FMRI的表观遗传沉默，导致FXS;FMR1 的甲基化发生在胚胎中并触发进一步的组蛋白修饰，增强基因抑制的强度76,77】。
虽然FRMP 功能的确切机制尚未完全阐明，FXS的第1组代谢型谷氨酸受体(mGluR) 理论为该综合征的神经和精神方面提供了令人信服的解释。FMRP 被认为通过通常抑制mRNA 翻译(除非mGluR 被激活)来帮助调节以上过程。因此，在没有FMRP的情况下，树突中的组成型蛋白表达似乎使 AMPAR 内化失调，因此阻断了 mGluR-LTD78]。
几个证据汇聚在一起支持这种对FXS 的解释。FMRI 敲除(KO) 小鼠的海马体中具有增强的mGluR-LTD 活性，即使没有新的蛋白质合成也显示增加的 mGluR-LTD的活性【79]。FMRP 由蛋白磷酸酶2(PP2A)去磷酸化发生在 mGluR 激活后不久，并与FMRP 靶标信息(例如PSD-95)的翻译一致80]。荧光原位杂交显示 FMRP调节的mRNA在野生型和FMRI KO 小鼠里都定位到皮质和海马神经元的树突，但刺激诱导的蛋白翻译在KO小鼠中受损811。FMRP 在由于mGluR 刺激的瞬时翻译增加之后不久会被泛素化和降解，但是使用蛋白酶体抑制剂来防止FMRP降解劣化却抑制mGLUR-LTD⁸2]。在培养的海马细胞中FMRI 基因沉默导致AMPAR内化的基础速率增加和对突触刺激的反应减少。因此，FXS中的智力残疾被认为是mGLuR-LTD的构成型活化和不能进一步增加响应刺激的突触蛋白质合成的结果84]。
雷帕霉素靶蛋白(mTOR)也是一个位于mGluR 信号传导下游的关键翻译调节子(参见参考文献中的图2-3)。mTOR的激活通过局部信号级联调节突触蛋白的翻译影响突触可塑性86]。 FMR1KO 小鼠显示增强的海马 mTOR 信号，其可能源于PIKE-S 合成的升高。PIKE-S 是 FMRP 调节的靶并且参与mGluR 刺激和mTOR 激活之间中间信号的传导步骤。
最近，参与mGluR 信号通路基因的高通量测序显示，与对照相比，特发性 ASD病例中罕见的、潜在损伤性的新生突变显著富集87]。总之，这些研究验证了突触功能障碍和神经元信号传导在FXS 和 ASD 中的作用，并且进一步论证了在这些路径中的病理生理收敛机制在两种疾病是常见的。

第2章从分子通路到ASD治疗：来自综合征类自闭症的领悟 23

结节性硬化
结节性硬化症(TSC)是一种显性遗传的多系统遗传疾病，在每11000活产儿中大约有1例患病88]。TSC的特征是出现在皮肤以及在90%的情况下在中枢神经系统(CNS) 中的错构瘤(肿瘤样结节)。癫痫和智力障碍与 TSC 具有非常高的共病概率(分别发生在80%～90%和44%～60%的病例中⁹0],而ASD共发生在高达50%的TSC病例中⁹1]。TSC由 TSC1或 TSC2中的突变引起，TSC1 基因编码错构瘤蛋白(Harmatin) 而 TSC2 编码块茎蛋白 (Tuberin) 。Hamartin和tuberin 形成参与mTOR 抑制的复合物，因此，在TSC 中，MTOR由于TSC1/2复合物功能的损失而活动过度。虽然大量不同结节性硬化蛋白的突变已编目，大多数的突变则导致蛋白质截断和发生在 TSC2 上。相似于FMRP,MTOR也参与翻译控制，其未受抑制的活性对应于蛋白质合成和细胞生长的增加93】。
除了在翻译和细胞增殖的调节中发挥广泛作用，TSC1/2 复合物似乎具体影响轴突、树突和突触的成熟和功能。轴突形成由细胞外的信号传导和内在不对称的极化介导⁹4。TSC1/2 复合体在所有神经突中出现富集。增长因子如类胰岛素-1(IGF-1) 和脑源性神经营养因子(BDNF) 激活 PI3K 和 AKT,其随后磷酸化和灭活TSC2。在新生轴突内TSC1/2 复合物的局部失活允许其通过MTOR 信号传播的轴突增殖，而剩余的神经突的生长被抑制961。此外， TSC1/2 的失活和随后MTOR的活化引起SAD 激酶的高度合成,其SAD 激酶是神经元极化的关键调节剂96,971。最后，TSC1/2 复合体的正常功能似乎是正确轴突髓鞘形成所必需的。
TSC1/2 复合物的功能受损也影响树突棘形成、结构和树突的树枝化。 TSC1 KO小鼠的树突显示脊柱长度和头宽度的增加以及脊柱密度的减少。培养的TSC1KO小鼠海马神经元共享这种树突状的形态，并且似乎具有增强的 AMPAR 激活。此外，与其FXS 相关的FMRP 沉默相反，在小鼠海马中TSC1或 TSC2的缺失消除mGluR-LTD101,102]。TSC2+¹-小鼠中mTOR的抑制挽救了它们异常的蛋白质合成和 mGLuR-LTD102]。此外，在成年 TSC2+/- 小鼠中，雷帕霉素(一个mTOR 抑制剂)的短暂治疗逆转了认知缺陷103]。 FXS 和TSC 都提示在突触极度活跃的mTOR信号是有致病性的。

ASD 综合征的新兴药物治疗

在过去十年对 ASD综合征形式的研究中最令人兴奋的发现之一是几种 ASD小鼠模型的行为和神经学表型可以在年轻和成年小鼠中逆转，其表明神

24       剖析ASD的遗传结构

经发育损伤不是永久性的，因此靶向药物治疗在人类患者中存在有效的可能性。恢复MECP2 缺陷的成年小鼠中的MECP2 表达逆转了它的神经和行为缺陷104]。同样显著的，mGLUR5 激动剂拯救了TSC 小鼠的表型，而 mGLUR5 拮抗剂能够逆转FMRI小鼠的病理变化。
基于积累的证据表明mGluR5 信号的增加与FXS 的病理生理学相关，测试mGluR5抑制剂在FXS患者中的效率的临床试验已经开始。非诺班(Feno- bam), 一个mGluR5的负性变构调节剂，已经在12名脆弱X 患者中展开了开放标签的研究测试。这项研究报告前脉冲抑制缺陷的中度逆转，而 mGluR5抑制剂的进一步随机双盲研究也正在进行中。
第一项即将完成的随机双盲研究结果表明，mGluR5 抑制剂治疗在具有 FMRI 启动子完全甲基化和血液中不存在FMRI表达的患者中，可以选择性地观察到显著的治疗效果，而在具有FMR1 启动子部分甲基化的患者中没有发现改善。

综合征性和特发性ASD 之间收敛路径的证据

鉴于针对 ASD 综合征形式的药物治疗更快地出现，阐明不同ASD 综合征形式以及综合征和特发性ASD 之间是否存在着机械重叠的共同机制变得重要。解决这个问题的最近进展在图2-1中被示意性地总结。
如上所述，脆性X 综合征和结节性硬化都与mGluR5 介导的突触可塑性和蛋白质合成受损相关。然而，虽然脆弱的 X 小鼠显示mGluR5 信号通路的过度激活，TSC1 或 TSC2 的缺陷却损毁了依赖mGluR5 的突触可塑性。因此，虽然两种综合征涉及相同的信号传导路径，它们以相反的方式影响，但却导致类似的自闭症行为。从这些动物模型重要启示表明①突触可塑性的调整非常精细，任一方向的变化可以触发病理表型；②使用为脆性X 综合征开发的药物治疗可能加重而不是减轻TSC 患者的症状。
虽然由于特发性ASD 潜在的基因异质性，理解ASD 特发性和综合征之间的机械重叠不够明确，但最近在识别可能的收敛路径的研究中有一些进展。
通过分析特发性ASD 患者的转录组数据，我们确定了一个在ASD 脑中下调的基因网络，神经元剪接因子(A2BP1)作为网络中的枢纽基因。有趣的是， A2BP1 是 MECP2 的一个转录靶点。此外，特发性自闭症患者的脑实质中具有更多活化的小胶质细胞。显著地，在 Rett 综合征小鼠模型[109中，行为和神经表型可以通过用野生型小胶质细胞重建大脑来逆转。这些数据表明小胶质细胞介导的病理可能在Rett 综合征和特发性ASD 中发挥重要作用，并且可以代表治疗的良好目标。

第2章从分子通路到ASD 治疗：来自综合征类自闭症的领悟 25

图2-1 连接综合征性和特发性ASD的分子和细胞机制

最近一项研究使用了人类cDNA文库的酵母双杂交系统来提出涉及综合征性和特发性 ASD 基因编码蛋白质之间的蛋白质-蛋白质相互作用的问题110。这项研究表明了SHANK3,一个涉及特发性ASD 的基因，与 TSC1交互，而这两个蛋白共享21个相互作用的蛋白，表明在TSC 患者和携带SHANK3 突变的ASD患者中可有相同的分子变化。
在HEK293,一个人胚胎细胞系中进行的FMRP靶标研究确定了93个先前涉及ASD的基因作为FMRP的靶标。此外，显示特发性ASD的NLGN3 敲除小鼠模型表现出与脆性X 小鼠中观察到相似的mGluR依赖性突触可塑性的变化112]。
虽然没有提供确定的答案，这些研究表明携带某些遗传变异(如SHANK3 或NLGN3)的特发性ASD患者可以受益于为综合征性ASD设计的特定药理学治疗。

未来方向

如果共享潜在的生物学机制，针对ASD 综合征的靶向药物治疗似乎开始

26       剖析ASD的遗传结构

触手可及，从而为特发性ASD 患者的有效治疗提供了特别的机会。因此，旨在描述综合征和特发性ASD 之间共性的进一步研究将是非常重要的。
如本章所讨论的，涉及特发性ASD 和综合征性ASD 基因的小鼠模型之间的表型重叠是非常令人鼓舞的，更多这样的研究很可能在不久的将来出现。然而，应当注意，表型表现，包括药物反应，很大程度上取决于基因组背景，因此小鼠研究的结果可能不容易被借鉴用来预测ASD 患者的治疗反应。
另一种方法是鉴定特异性内表型，即是综合征性 ASD 和一部分特发性 ASD 特征的生物标志物和神经生理学标志物。最近的一项研究比较了特发性 ASD 和 TSC的脑电图(EEG)连通性，目的是确定常见的神经生物学机制113。这类数据可能有助于识别某些自闭症亚型，它们可能会从为综合征ASD 患者设计的治疗中受益。
将针对综合征ASD开发的新疗法随机选择的用于特发性 ASD 的患者具有潜在的不良反应的风险(如以上针对脆性X 综合征和TSC 的讨论),并且可能由于特发性ASD的异质性特征被错误地认为无效。因此，识别响应于特定药理学治疗的 ASD患者所属亚型仍然至关重要，而预期个性化药物将为这样的努力带来有益的贡献。

本章要点

●特发性 ASD 是高度遗传性但遗传异质性高的病症。尽管在进行大量的研究工作，ASD的异质性阻碍了靶向药理学治疗的发展。
● 脆性X 综合征、Rett综合征和结节性硬化症是具有很高自闭症发病率的遗传综合征。
● ASD综合征的分子机制已经在动物模型和细胞培养系统中广泛表征。因此，对于ASD综合征的靶向药理学治疗的发展比对特发性ASD 的研究进展更快。
●一种新型用于ASD 的药物，mGluR5 拮抗剂，目前正在进行治疗脆性X 综合征的临床试验。
●最近综合征性和特发性ASD 中的几种常见的分子和神经生物学机制已被阐述(见图2-1),其提供对于特发性ASD患者有效靶向治疗的希望。

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第 3 章

自闭症谱系疾患的语言障碍

Natalia    Rakhlin,Elena    L.Grigorenko 刘君王一迪译，孔学君校

摘要
研究复杂的、神经发育表型的共享功能维度可能有助于理解其共同病因。我们将这种维度方法应用于自闭症谱系障碍(ASD) 和语言障碍(LD) 的研究，并总结了迄今为止关于ASD语言障碍的研究。虽然目前的情况仍然复杂，这种方法有潜力阐明ASD的生物相关性和/或原因，从而有助于有效的临床干预的发展。
关键词：发育障碍的三维分类；异质性；自闭症谱系障碍；语言发育障碍；定量和分子遗传学。

前言

近年来，研究神经发育障碍的方法，遵循一般精神病学的类似趋势，已经开始从类别分类方法(例如 DSM-IV 和 ICD-10的分类系统)转变为维度方法。类别分类的公认缺点在于它们是基于建立了临床症状群而不是已知的因果机制的疾病分类学系统的有效相关性，因此它们对于确定最有效治疗的效用有限1,2]。新的维度方法旨在结合来自遗传学、神经科学以及认知和行为科学的多个层次的分析，通过这些多层次分析中描述每个维度功能特征，从而将行为症状与特定认知过程的中断联系起来，在神经解剖学和/或神经生理学的水平以及基因组结构和/或功能水平得以测知。维度方法假设复杂病症表型中观察到的各个性状可彼此分离，使得作为多种病症表型组成部分的各个性状，可以解析我们所观察到的共病³。这种维度方法是出于基因和行为之间复杂疾病固有的表型和遗传异质性以及映射的非线性关系，其使得类别分类方法失去效用。理解这些疾病的生物机制需要把表型剖析到理论上更能动的维度结

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构[4并在交叉综合征组中研究这些构建体(相对于所讨论的性状表型同质), 而不是在共享相同分类标签的异源群体里。
ASD中的语言研究是一个特别适合于使用维度方法研究的主题，因为 ①在ASD个体中所观察到的表型有很大的异质性；和②现存有另一种临床类别，即语言障碍(LD),尽管目前在临床诊断用法上与ASD互相排斥，却具有长期以来被认为与ASD相关的表型(具体为语言获得和功能障碍)。虽然自闭症的原始描述不包括语言障碍5,一些早期研究者将ASD 和 LD 概念化为在相同认知障碍形式里的不同严重程度6。随后，ASD 和 LD 儿童之间语言特征的实质性差异被指出。首先，在ASD中(所有功能水平的患者里)最常见的语言障碍类型涉及社会情境中的语言使用(务实的沟通方面),而不是语言的结构方面，这与LD 中发现的模式相反，即使结构语言也可能在患有ASD的个体以及语用学在LD的个体中受损。此外，还存在其他ASD 特定与语言相关的特征，例如，“自闭症退化”或通常观察到的在看似正常发展后的第二年生活中失去交流技能7,8]、异常的声音现象(例如模仿言语)以及语义异常，如新词和代词逆转。
尽管这些差异的存在，一些研究也显示LD 患儿和一些ASD 患儿的语言特征中存在多种相似性，例如延迟达到早期语言里阶段、形态句法错误(如省略动词时态标记),以及重复假词的困难。这些相似性被视为ASD 亚型的证据，即具有语言障碍的 ASD(所谓的ALI)⁹], 或为“LD附加物”。另一方面，也有人提出ASD 和 LD 可能仅在表面上重叠，纵然两者没有共同的病因学1。然而，两个诊断类别(ASD 和LD) 如何与现象学相关变得不那么重要，因为该领域已经开发了对复杂疾病(例如ASD 和 LD) 的多因素/维度性质的理解，并转移到在各个层次研究这些维度，假设任何一个或多个维度都可能在任何个体中受到影响。
关于ASD,有人建议典型的自闭症行为特征是可分离的(“可分割的”), 使得每个性状可以在行为症状、认知基础和病因学的水平上独立地研究4]。将语言障碍理解为与ASD和 LD 相关的功能行为维度，同时区分主要语言障碍与继发于社会障碍是发现富有成效的内表型(中间表型)的一种方式。这些发现将有助于克服ASD行为和遗传异质性所呈现的挑战，并有助于检测与这些病症特定方面相关的遗传变异。
ASD 和 LD 症状的部分重叠被认为支持维度方法基于以下的证据：①在 ASD 和 LD个体中语言表型的部分重叠；②ASD 患者父母和兄弟姐妹表现出语言障碍，亚临床语言和语言相关缺陷的风险上升，以及在LD 患儿的亲属中具有ASD样症状的风险增加；③由分子和遗传学发现ASD和LD的共享遗传风险因素。本综述旨在总结这些研究领域的每个主要发现，并概述目前对语

第3章自闭症谱系疾患的语言障碍 37

言障碍与广泛ASD 表型之间关系的理解。对这种关系更深入的理解对于搜索 ASD的生物学相关性/原因和相应的临床干预的设计具有重要的意义。

ASD 中的语言障碍

表型异质性的来源
大多数ASD语言功能的研究专注于语言习得的产物，即在ASD儿童组中的语音学、词汇学、语法学或语用学发展的水平，据报道所有的领域，除了语言的实用或社会使用受损外，都是高度可变的¹2]。相对来说，较少的研究检查了 ASD儿童语言习得的过程或机制。 ASD个体功能水平的大幅度变化对这样的研究提出了挑战。
有相当部分ASD患者(25%～50%)是非言语功能的。另一个大的子组由没有临床水平语言异常(先前被鉴定为高功能自闭症或阿斯伯格综合征)的个体组成。其余的组显示高度可变的语言功能，症状的严重程度通常与智力残疾程度相关13]。因此，现有文献包含了与ASD个人语言特征相关的发散发现，这取决于研究是否来自“语言正常”(通常在语言形式方面仅具有微妙的缺陷，例如语音或语法)的样本，“语言障碍”(通常显示不同程度的结构性语言障碍)或混合(未选择)语言能力的个体14]。这种差异帮助促成文献报道结果的异质性。
ASD语言概况异质性的另一个来源是在更广泛 ASD 症状学背景下的语言发展动态【15]。换句话说，取决于ASD症状的严重程度以及研究样本中参与者的年龄，语言障碍的规模和质量在一般情况下(特别是在结构语言中)已有很大的差异。大量(高达63%)15]6岁以下的ASD儿童表现出接受-表达性混合的LD, 包括语法和发声的缺陷，但有一定数量随着时间的推移随后将言语- 语言障碍降低到亚临床水平，这种减少取决于总体功能水平16]。
此外，在经历所谓的“自闭症退化”的ASD 儿童中有观察到不同的语言发育轨迹。在随后诊断为ASD的儿童被持续报告出现语言迟缓17之外，大量病例(15%～49%)显示的不是延迟，而是以前通常获得的技能(词和短语语音) 的相当突然的损失，通常在14～24个月之间18]。这种现象，其原因仍然未知，对 ASD 高度特异。其后续语言习得的后果取决于回归是在语言出现之前还是之后发生。因此，那些获得了表达语言后退化的儿童的语言和智商结果较低，而那些在语言出现之前经历退化的儿童一般与没有经历退化的ASD儿童没有区别。
作为ASD的临床现象的一部分，语言延迟和语言丧失的似乎自相矛盾，这

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可以解释为将语言延迟和语言丧失视为发展脆弱性的两个单独的线。自闭症退化可能是一个比现在所观察到的更广泛的现象，因为在大量的情况下，退化可被语言延迟掩盖，其经历实质语言延迟的儿童在生命的第二年期间没有明显的语言[201。这一观点与语言延迟和自闭症退化源于不同的病因学因素相关，前者在ASD和LD 中起作用，后者特异于ASD并与广泛的ASD表型相关。
ASD 语言障碍的类型
尽管ASD患者的语言特征存在差异，但仍有一些共有的症状。与ASD 诊断相关的最常见的缺陷是社会使用语言(语用学)。然而，研究还发现了结构语言(词汇和语法)和语言声音方面的障碍。这些语言功能方面的严重障碍通常存在于功能较差的儿童中，而在高功能的儿童中仅发现这种类型的微小的障碍。
即使在具有良好语言功能的人群中，也观察到社交语言，即语用学(广义定义)方面的功能障碍。患有 ASD的儿童难以引发对话，难以遵循会话的规则，比如轮流说话，保持主题(通过添加相关信息并引入新的相关主题来持续切合主题的对话)和信息管理(取决于听众的需要，在会话中提供适当数量的信息)21]。研究也证明了他们对叙事方面表现不佳22],难以理解比喻语言。他们的语言通常被描述为过于学究气，过度正式和呆板。这些特征是 ASD的最一致的语言标记。
然而，社会使用语言的困难不是 ASD 特有的，它在LD 患儿中也有发现。此外，添加到DSM-5心理学诊断指南(社会交流障碍)中的一种纯语用障碍，患者包括了与ASD 儿童具有相似社会交流困难的儿童，但这些儿童没有其他 ASD 症状的存在(即除语言沟通障碍以外的刻板行为和互动困难)。下面，我们将简要回顾ASD 患者关于词汇、语言形态和语音技能方面的主要特征。
关于词汇，许多ASD儿童(类似LD的儿童)在开始使用词汇和获取新词汇方面存在明显的迟缓,也是随后其能否发展适应性行为的准确预测指标之二。一些研究报告表明，ASD 儿童与LD 儿童不同的一点是ASD患者通常在标准词汇测试中表现不佳。
然而，患有句法障碍的ASD的儿童，类似于患有LD的同伴，研究显示他

第3章自闭症谱系疾患的语言障碍 39

们拥有稀疏的词汇，以及对这些词汇仅有支离破碎的理解并且对词跟词之间的关系有不成熟的认知【35]。在一个有关复合名词理解的研究中，伴有语法障碍的ASD 儿童和LD儿童之间有类似的行为重叠。尤其值得一提的是，对于非单词重复任务表现较差而同时词汇量较差的儿童，无论其具体诊断结果如何，他们都对理解复合名词有更大的困难。这种重叠表明，语法和词汇的交叉缺陷是ASD 和LD 表型所共享的语言障碍。
但我们很难详细描述这种行为重叠的细节或ASD儿童的词汇语义发育的精确表征。已经有研究表明，与TD 儿童相似，ASD儿童表现出过多使用名词 (名词偏见),可以表达具体和抽象名词的意义的词汇语义理解错误。所有这些都表明词汇采集机制在ASD中通常是完整的。然而，研究也观察到ASD在词汇处理方面的异常，包括词汇和/或类别组织的缺陷。值得注意的是，这些障碍是高度多样化的，包括缺乏在24个月龄时的形状偏见(即默认假设对于新物体的标注指的是其形状),成人ASD对于动作动词语义处理的障碍44],在事件相关的潜在任务期间对语义不一致的词的异常神经生理反应。此外，在选择一个不熟悉的新词所对应的物体时，ASD 使用他们自己的注意焦点而不是使用典型的“说话者凝视方向”策略(即假设新词的对应物和讲话者在说出新词时正在看的对象一致),因此经常错误地标记对象47]。眼动跟踪实验表明，ASD儿童对于眼神中所蕴含的社交信息具有较低的敏感性。这表明社交障碍(例如社交取向和联合注意方面的缺陷) 可能会妨碍ASD儿童觉察到语言交流中所暗示的社交信息，从而影响他们对词语含义的理解。然而，ASD儿童拥有在词语学习中使用句法提示的完整能力，并且对听觉刺激(例如语调和言语声音)表现出正常的神经反应。而LD儿童在这些方面有缺陷53]。这些 ASD与 LD的对比研究表明，两种不同的机制会导致这两种疾病的词汇障碍。在同一患儿中，一种或两种机制都可能受损。
LD中语言障碍的最突出特征是关于句法和语言形态技能的缺陷。这些缺陷在ASD中是混合的。一些研究报告自发性言语没有形态学错误⁵4],而其他研究显示语言障碍亚型ASD 儿童在时态指标上有高遗漏率，并显示较少的表达和接受性语言的语法指标。高功能的ASD儿童与跟其智商、年龄和接受性词汇量相匹配的TD 同伴相比，他们在自由游戏会话中具有较低的平均发音长度，和对语法违反时态规则及方面动词标记的较低敏感性。因此，虽然明显的句法和语言形态学的障碍不是ASD 表型的象征性特征，稀疏的表达性语言可能反映ASD 较慢的语言发育，也可能是一个广泛的特征。一些 ASD儿童在这方面的语法缺陷和LD患儿十分类似。

40       剖析ASD的遗传结构

最后，在一些研究中显示，ASD 患者有正常的语音学特征，特别是表达性语音。但是其他研究中发现ASD 患者至少包含细微的异常57,58]。一个使用聚类分析方法，针对7～9岁ASD儿童的研究发现了四种不同的ASD 语言特征59,其中两种语音受损，而另外两种语音正常(有或没有共存的语言理解缺陷)。语音缺陷和语法障碍一样，经常在患有LD 的幼儿中被报道(从轻度到深度)。这些障碍在ASD 临床上也比较常见，却不是普遍的特征。有一些证据表明，语音缺陷倾向于与语法缺陷共存，而语义缺陷通常与语用缺陷共同发生。
语言能力和ASD的诊断
目前已有明确证据表明，儿童的语言技能和相对于年龄的语言迟缓程度对于ASD的诊断、病情进展和治疗具有高度指导意义61,62]。并且特有的诊断特征与语言技能水平密切相关。然而，语言延迟不是最新 ASD 主要诊断标准的一部分。因为如上所述，它不总是存在，也不是ASD 特有的。DSM-5中针对自闭症的定义调整反映了该领域对于语言障碍是否是ASD固有特征的不同观点。以前，自闭症被定义为三组核心障碍，包括交流缺陷、交互式社交障碍和机械性重复行为。DSM-5保留了后两个方面，将交流缺陷并入了交互式社交障碍的领域(可以在此领域中添加语言障碍一项)。另一方面，DSM-5 很清楚语言障碍是ASD的组成部分，因为在DSM-5中提供的诊断ASD 严重性的目录中包含了语言障碍程度：描述 ASD 最高严重性的例子包括“一个寡言少语并且言语不清晰的人”;2级为“一个说简单句子的人”;和第1级作为“一个能够用完整的句子说话并进行交流的人”。

关于ASD 和 LD 表型重叠的家庭研究

关于ASD 和 LD 患者亲属的沟通困难的家庭研究明显地表明这些疾病中语言障碍有遗传基础。研究LD 和 ASD的共同病因的一种策略是，找到患有一种疾病的先证者的近亲，对其进行另一种疾病相关症状的诊断。这样的研究表明，ASD 患者的家庭成员中语言和跟语言相关的学习缺陷的发病率高于预期，例如阅读和拼写。此外，研究报道ASD先证者的一级亲属中有显著数量的亚临床水平的类自闭症特征，包括交流和语言缺陷。这类群体被称为所谓的广泛自闭症表型或BAP。
语用学是BAP最常见的与语言缺陷相关的组成部分，ASD父母的评分低于对照的儿童的父母68。特别针对结构性语言的研究通常将 ASD 儿童父母的语言技能与LD 儿童父母的语言技能进行比较。所有研究都显示后一组语

第3章自闭症谱系疾患的语言障碍    41

言技能较低，并将这些发现解释为ASD 和 LD 之间的无共享遗传病因学的证据⁶⁹ ]。最近的一项研究没有采用这种比较方法，而是检查了扩大家庭中语言障碍的发生频率。这些家庭包括至少一名诊断为 LD 和一名诊断为 ASD 的成员70]。结果表明，控制ASD后，总体语言能力和实用语言技能遗传性更高。这些结果与简单叠加性遗传模型不一致，而是与导致ASD的非叠加遗传效应一致。也就是说，它们支持基因-基因相互作用模型，这可以解释ASD 和 LD的共同的遗传病因，同时仍然允许导致不同诊断的表型差异。

ASD/LD重叠的分子遗传学研究

许多分子遗传学研究发现了ASD 和 LD 的易感性标记，以及新生和遗传的拷贝数变异(CVN) 对 ASD的致病影响71]。这些研究有力说明这两种疾病是复杂的和多基因的。在寻找从基因到表型的途径中，一个重要的问题是， ASD的不同方面是否具有独立的遗传基础，或者，它们是否与大量重叠的风险因子相关。为了支持ASD 相关的缺陷区域的独立遗传，连锁研究已经鉴定与语言和非语言障碍相关的内表型相关的不同基因座72]。还有一些证据表明 ASD和 LD 在特定基因家族(例如，信号素基因)或基因组位置(例如， 17p11(76,77)中的病原学重叠73-75]。
此外，研究已经提出了ASD 和 LD 之间似乎合理的功能链接。首先，一系列论文将CNTNAP2 鉴定为增加家族性ASD 风险的基因78-80】。随后，该基因被报道与LD相关81],提示两种疾病之间的表型重叠的遗传机制。已经有研究发现CNTNAP2 在发育中的人体大脑皮层中表达并且编码神经元蛋白，此蛋白是参与神经元黏附的突触前蛋白。其在普通人群中与2岁时的交流能力相关82]。此外，CNTNAP2 被 FOXP2下调，而FOXP2 是以前在一个大家族中发现的罕见的单基因交流障碍相关基因83]。还有，有趣的是，Vernes 和其同事的研究81]中使用的表型是无意义单词的重复，这是在其他研究中使用的LD 的临床标记。这个表型至少在一些ASD亚组儿童中受损34]。

结论

在 ASD 和 LD患者中发现的语言功能缺陷有两个不同的领域被识别为交流障碍的一部分：①结构语言，其包括词汇和语法(语音或声音模式、词语形态或词形成模式、语法和组成语义)和②语用学。LD 与第一个区域中的缺陷有最显著的相关性，而ASD与第二个区域中的缺陷相关。但是这两个疾病都包括在任何两个区域中具有缺陷的儿童。此外，在患有LD 的儿童和具有ASD

的儿童亚组中，语言的产生(发音)可能受损，在后者中经常与结构语言障碍重叠。
行为和遗传研究表明ASD儿童语言缺陷的多样性可能源于两个不同的病因来源。一个是对于社会认知的广泛的缺陷，导致ASD 的实用性语言障碍，和由于患者无法理解社会线索导致的孤独症特有的词汇学的缺陷。另一个病因可能直接导致结构语言的缺陷，但只影响一部分ASD 患者。因此，ASD中的一些沟通障碍，例如特殊的词语使用、理解缺陷、语用上的缺陷和语言的社会使用困难，可能是导致自闭症典型性状出现的某些特定因素的结果(即社交障碍)。另一方面，其他一些症状，如语言形式方面的障碍，可能是由于接受性和表达性语言的缺陷因素导致的。这些障碍在LD 和 ASD 中都有表现。这些因素可能特别影响语言发育，或可能是一种“普遍”因素，对儿童发育产生普遍迟缓的影响。此外，也可能存在一些与社会和语言缺陷不相关联的影响发育的因素，导致例如在ASD 和LD 中发现的一般语言和认知发育的迟缓。因此，这两种疾病的遗传模型无疑是非常复杂的，因为它们涉及多个基因、基因和基因之间、基因和环境之间相互作用从而导致疾病表型。更为复杂的是，基因可以多效地作用，导致众多方面的缺陷。
表型复杂性的另一个来源是不同语言域的交互性本质。尽管不同的语言域经常被视为具有各自的神经回路的自主认知系统，但是它们可以在功能上相互影响(即一个语言域的损伤可能影响技能的获取和/或导致另一个域的性能降低)。因此，在具有社交方面交流障碍的尤其是比较严重的ASD 儿童中，社交障碍可能损害其他语言域中的技能的获取；相反，LD 的主要缺陷是结构语言，这些儿童的实用语言技能可能受损，导致跟ASD 表型相似的症状，尽管两者没有实际意义上的病因学重叠。

未来方向

探索发育性疾病尤其是ASD 和 LD 的表现及病因的异质性仍然是当今 ASD 研究的主要任务。本综述所代表的领域包括对ASD 和 LD 的共同病因的暗示性证据。为了解决文献中的这些矛盾，该领域必须参与更多的研究，其中样本的建立不是基于诊断类别，而是基于语言维度缺陷。尽管这样的研究目前罕见，但它们可能极有助于解决这一领域目前面临的大量矛盾。

本章要点

●当今关于ASD的文献是庞多和令人印象深刻的；然而它们的可复制性存在

第3章自闭症谱系疾患的语言障碍    43

很多问题，至少部分是由于ASD 本质上的异质性。
·ASD 临床表现的一个重要方面，也是其异质性的来源，是语言功能的水平。
●语言障碍本身(无论是独立的临床症状还是另一种发育障碍，例如 ASD 的一个方面)是许多潜在的特有或非特有因素单独或共同表现的异质结果。
● 当把ASD 和 LD 的行为表现的维度放在一起考虑时，有证据表明，在其心理特征和潜在的病因学机制方面，两种疾病之间存在重叠。
● 了解 ASD 的维度结构并探索这些维度在多种发育性疾病中的病因学是未来的重要任务。

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第 4 章

自闭症的全基因组测序：临床转化

RyanK.C.Yuen,StephenW.Scherer
丁信嘉译，丁岩孔学君校

摘要
自闭症谱系障碍(ASD) 表现出高度遗传性和家族聚集性。ASD的病因学因素目前包括染色体异常、拷贝数变异(CNV) 、小的插入/缺失(indel) 、单核苷酸变异(SNV) 及其组合。事实上，现在已知的ASD风险基因超过100个，而且预计还有其他几百个风险基因存在。全基因组测序(WGS) 有希望成为一个用于在单个实验中鉴定所有类型遗传变异的工具来确定其余的 ASD 风险基因。我们的预试验研究使用了WGS和细致的生物信息学来分析检验新生的和罕见的遗传突变，的确获得更多的导致 ASD 及其伴随的临床综合征的病因学遗传变异。这些早期的成功表明WGS 可用于帮助指导许多受ASD 影响的个人和家庭的个性化临床管理。
关键词：全基因组测序；新生突变；遗传有害突变；遗传异质性；拷贝数变异；临床转化；医疗管理；临床诊断。

前言

自闭症谱系障碍(ASD) 是一种终身发育性疾病，影响大约1%的人口。其特点是非典型发育的社会技能和交流，以及存在局限性兴趣和重复性的行为。发病通常在三岁之前，其表型存在高度的异质性。损伤水平变化可从轻度到严重，认知能力也可以从高于平均水平到智力障碍。除了这种复杂性，ASD 还常常伴有焦虑、智力障碍、睡眠问题、癫痫发作及胃肠道或其他并发症1。
家族研究表明了ASD 易感性的重要遗传基础。 ASD的遗传率估计可高达90%(范围为37%～90%),使其成为最受遗传影响的神经精神障碍之二。尽

50       剖析ASD的遗传结构

管存在广泛的遗传异质性，累积的证据都指向突触信息通路的调节异常5-7]。知识的进步很大程度上归功于快速发展的新技术，如基因芯片和高通量测序的发展，可以捕获以前无法实现的广谱基因组变异。尤其是最近证明全基因组测序(WGS) 对于临床检测 ASD的相关基因突变是高度有效的技术手段8。进一步了解ASD的遗传病因有助于诊断/预后、医疗管理、家族性复发风险评估等，也可促进基于遗传途径特点的药物干预临床试验1,9。
本章中，我们将讨论①从高通量测序技术发明前后两个时代对ASD 遗传学的理解，②用WGS方法分析和研究遗传变异的策略，③WGS在诊断和治疗 ASD 中的意义，④使用WGS方法进行自闭症临床遗传研究的未来方向。

从高通量测序时代前后了解ASD遗传学

ASD的遗传基础源于早期家族研究，其研究表明受影响的先证者的兄弟姐妹具有2%～9%的发病率。 ASD 在同性双胞胎中的流行病学一致性研究也一直支持遗传解释，在多因素阈值模型下的遗传性范围从37%到大于 90%[2,3 。ASD 的个体越来越多地进行临床遗传学评估，并且10%的个体具有可识别的遗传病症，例如脆性X 染色体综合征。这些致病突变可通过靶基因测序或定量检测分析来检测11。
ASD的遗传结构-在高通量测序出现之前的知识
使用单核苷酸多态性(SNP) 的连锁分析最初定位了一些ASD的候选风险基因，有些风险基因显然在不同的队列研究中得到了重复验证,或可能与 ASD的复合表型如焦虑有关，或与语音和语言属性有关。
现在有大量证据表明罕见(<1%小的等位基因频率)和新生变异，例如影响特定基因和基因座的拷贝数变异(CNV) 是造成ASD的病因之一(表4-1)。关于罕见的CNV, 基于芯片技术的大型ASD 队列研究结果(在参考文献10中概述),揭示了以下性质：①取决于样本的确定标准，CNV 可以解释5%～10%原因未明ASD的病例，但到目前为止每个风险基因座或基因发生频率都小于 1%;②具有多种临床指征和先天性异常的ASD受试者通常携带有一个(有时超过一个)大的新变异和/或影响许多基因的遗传性CNV;③一些新变异或遗传性

方法    可检测的遗传变异    临床相关变异       主要发现                                  参考文献

靶向SNV和indel(编码/ 非编码)

微阵列

全外显子测序 (WES)

全基因组测序 (WGS)

靶向高通量测序

常见的SN,罕见/新生 CNV

SNV,indel,CNV(编码)

SNY,indel,CNV(编码/非编码)

靶向SNV,inde,CNV(编码/非编码)

常见的SNP

稀有/新的CNV

新生SNV和indel

稀有遗传的SNV

新生/罕见遗传的SNV, indel和CNV

新生SNV和indel CNV 连接处的断点映射

●常见作为ASD变异可能的风险(或修改)因素
●增加5%～10%的ASD风险
●复杂的ASD病例具有大的CNV
·CNV与其他神经精神障碍相一致功能丰富的神经元突触和发展基因
●贡献ASD风险的6%
·ASD个体中新生无义突变体增加2～4倍
●在包含ASD风险的基因中确定新的ASD风险基因数百个
●贡献ASD风险的约5%
●在ASD个体中基因的完全敲除增加1.5至2倍
●新的ASD风险基因鉴定为双等位基因突变
●罕见突变散布在数百个ASD风险基因中
● WGS在已知的ASD基因上具有良好的覆盖
●临床相关变异可在多达50%的ASD病例中发现
●新生突变率随父亲年龄增加
●突变热点富集一些已知的ASD基因
●每个ASD风险基因贡献的ASD病例的频率<1%
●确定新的ASD风险基因

15
5-7,10

24-27

30-33

8,42

29
34

CNV 与已知的医学基因组病症吻合，而其他的变异涉及ASD、智力障碍或其他神经精神病症相关的基因；④存在影响神经元突触和发育基因的CNV 的富集5-7,17]。
这些数据还表明ASD个体可能具有多重遗传风险因素。例如，一些具有更多潜在相关CNV的先证者以及由两个兄弟姐妹携带CNV的家族，一个受影响，一个未受影响，表明建立罕见CNV 的因果关系可能很困难18-201。有些研究更确切地表明单个个体具有多个遗传病变很可能是导致 ASD 的必要条件。这些基因中的大多数已经与智力障碍有关，说明这两种神经精神障碍常常伴有一个共同的遗传基础5。与其他神经精神疾病一样，ASD 和癫痫之间的遗传重叠在很多病例中也很明显。
来自通量测序的遗传发现
识别ASD风险基因的新方法包括人类DNA的全外显子组测序(WES) 寻找新生突变(主要集中在单核苷酸突变)(表4-1)。WES 解析蛋白编码区域，大约占全基因组的1%。这些研究项目结果表明①ASD 个体与其未受影响的兄弟姐妹相比新生无意义变异增加了2到4倍，②新生SNV 约占 6 % 的 ASD风险，③可以发现一些新的ASD 风险基因(例如CHD8、DYRK1A、KAT- NAL2、POGS和 SCN2A),④ 可能有数百个ASD相关的风险基因28,29。
除了新生突变，遗传性突变也在基于WES技术的其他几个研究中进行了检验(表4-1)。这些研究表明①通过近亲或非近亲家族的纯合定位策略，罕见的双等位基因突变可以在已知和/或新型ASD基因(例如UBE3B、AMT、PEX7、 SYNE1、VPS13B、PAH 和POMGNT1)中被识别出来30,31],②与对照组相比，在 ASD 病例中，常染色体基因和X 连锁基因中罕见的功能丧失(LoF) 遗传突变分别增加了2倍和1.5倍[³2],③通过遗传性LoF 突变基因的罕见完全敲除占另外5%ASD的病例³2],和④罕见突变散布在数百个风险基因中，因此，使用遗传关联实验来鉴定更多的新型 ASD基因需要超过数千个样本。
其他方法也被用于检测潜在的 ASD 临床相关变异(表4- 1)。例如， Talkowski 等运用高通量测序具有碱基对分辨率的优势，来定位以前确定的大规模均衡染色体异常的断点，从而确认了与ASD 和其他精神疾病有关的33个假定的基因座/基因[³4]。另一种方法是使用一系列过滤参数从现有的公共人口数据库中优先排序筛选出ASD 个体的罕见突变。这种方法已经应用于两个分别使用全外显子和基因内383风险基因位点，以及非编码RNA³9,也与ASD易感性相关。
随着分辨率不断提高的新技术(细胞遗传学、微阵列、外显子序列测序)出现，我们在识别新的ASD 风险变异方面已经取得了显著的进展。尽管如此，当

第 4 章自闭症的全基因组测序：临床转化    53

把所有来自这些互补方法的数据组合起来时，ASD 的病因学仍然不完全清晰；到目前为止，至多只有约20%ASD 病例的病因学基础能够解释10]。高度遗传性评估和家族研究重新确认了遗传因素的影响，表明更多的遗传性变异仍然等待挖掘，并用于疾病相关性研究。

由 WGS识别的遗传变异的分析策略

全基因组测序(WGS) 有希望成为一个用于在单个实验中鉴定所有类型的遗传变异的工具来确定其余的 ASD 风险基因。我们开发了一种用于使用

二

通过全基因组测序的ASD 三重序列的基因组

SNV 和indel检测
dbSNP和1000个基因组中的变异

来自高分辨率芯片中的CNV
SNV检测(多种算法)
DGV中的CNV

新生变异
(增加手动评估)
segdup和重复区域中的变异

继承X连锁变异

继承了常染色体的变异

新生CNV 继承CNV

变异的注释

罕见的有害变异
(LOF: 无义，剪接位点，移码预测的损伤错义，大规模删除/重复)

A. 医学注释
●预测对基因的功能影响
●覆盖有ASD 候选基因
●比较OMIM
●动物模型(小鼠基因组信息学)

B.家族的分析 ●隔离
●基因型-表型相关
●先证者临床再评价
●家庭成员评估

通过sanger 测序/qPCR 验证

分类已知，新型或候选ASD的风险基因

管理意义

图4- 1 用全基因测序方法对自闭症相关基因的检测和分类流程图

54       剖析ASD的遗传结构

WGS进行变异检测的综合工作流程(图4-1),并从基因组和医学方面评估每个变异与ASD 的相关性(图4-2)。使用这个工作流程，我们在一个32个不相关的ASD 家庭队列的试点研究中，即使只关注基因区域，也能够在50%的病例中检测出与ASD或相关并发症的临床相关变异。我们的方法依赖于开发一个完整的生物信息分析系统，它可以对ASD 进行强大的变异检测和注释。我们也试图最大限度地利用含有等位基因频率以及功能遗传信息的所有相关公共数据库，以更好地描述导致ASD风险的遗传变异。在这里，我们将此工作流程扩展到CNV的识别及鉴定。我们坚信这个分析平台能够从WGS中获取最有用的信息，并促进这些信息的转化用于临床诊断和医疗管理。最近还有一些使用WGS 研究ASD的论文发表【36,42],但到目前为止他们的设计也只产生了一个不太全面的随访研究数据而已。

图4-2 全基因测序资料分析过程中需要考虑的医疗和基因因素(改编自参考文献
图2)

遗传变异的发现

为了检测新生和遗传性突变，来自索引病例(也称为先证者)和他/她的父母的DNA(即三人组)以及尽可能的其他家庭成员的基因组都要进行分析。通常可以从血液中提取高质量的DNA,并使用双末端文库方法测序出至少30倍的基因组覆盖的深度8]。我们可以使用来自淋巴母细胞样细胞系的DNA,

第4章自闭症的全基因组测序：临床转化    55

但是考虑到细胞系的创建或培养过程中可能引入遗传变化，所以我们需要非常谨慎，稍有不慎，这样的改变将错误地显示为新生变异。使用过滤程序有可能会消除或减少这些人工体细胞变异。在临床实验中非常需要对所有变异进行独立的实验室验证(诸如用于SNV 验证的Sanger 测序和用于CNV 验证的qPCR)
目前，Illumina和 Complete Genomics是两家能够提供运行强大的WGS技术平台的主要公司。其他公司也在试图开发更经济和更高通量的测序平台 (例如 Life Technologies的 Ion Proton,Oxford Nanopore)。大部分的高通量测序技术只能产生短读数(范围35～100个碱基对),这对尝试从头合成DNA序列的装配造成了困难。而后，测序读数必须使用像 Burrows-Wheeler Aligner (BWA) 这样的生物信息学工具来与人类基因组参考序列(在编写时称为版本 hg19)进行比对或定位。应根据测序平台来选择比对工具。可用的工具及其应用可参考文献。局部重排和质量重新校准能够检测出单核苷酸变异 (SNV) 和小插入/缺失(indel,大小为1～100碱基对)。基因组分析工具包 (GATK)是最常用的变异检测工具，它可以去除重复的读数。基因组变异的效应(例如，错义、无义或移码突变等)和分类(例如，在外显子、内含子或基因间区域)可以通过诸如ANNOVAR的程序诠释。
新生SNV 及插入/缺失突变
新生(denovo)突变是可能出现在亲本生殖系组织中的新的突变。然而，由于在测序、比对期间或变异定位中会产生技术假象，所以从高通量测序中检测新生突变可能具有挑战性。目前已经开发了一些方法，其可以从假阳性新生突变中区分出新生突变。这些方法包括从基于机器学习到基于统计的程序47。一般来说，如果一对纯合参考基因型的父母产生一个杂合基因型的后代就有可能识别出潜在的新生突变。然而，这种方法仅适用于基因组中的常染色体区域，对于覆盖男性的X 染色体还需要更多的工作(见下文)。类似的过滤标准可以应用于新生的indel 检测；先证者是杂合子插入/缺失突变，而在参考基因组中的相同位置父母都是纯合子。然而，根据我们的经验，在人口数据库和简单的重复区域中的新生indel 检测是容易出现假阳性的，所以在诸如 SNP数据库(dbSNP) 和位于简单的重复区域的 indel 通常会被过滤掉(图4-1)。
人工评估潜在的新生外显子变异
用于检测新生变异的标准自动检测方法通常仅考虑在亲本中是纯合的和在先证者中是杂合的新生变异，而与男性X 染色体上发现的变异无关。按照

56       剖析ASD的遗传结构

我们的经验，为了实现这一点，在男性受试者中发现X 连锁的半合子变异需要人工分析，因为它们不存在于各自母亲的X 染色体上的相同位置(即男性中新的 X 连锁突变先验概率)。此外，通过上述检测方法可能会错过一些变异。这对于indel 尤其如此，即高通量测序的短读数下，检测仍然可能有问题。因此，由自动变异识别系统发现的潜在的新生外显子SNV 和 indel 经过优先筛选后要经过靶向Sanger 测序进行验证。
WGS 的 CNV 检测
尽管用于CNV 检测的临床芯片现在已经作为常规的 ASD“临床标准”。这些方法应用以下原理：①“基于组装”的查询基因组与参考基因组的比较，②查询读数末端序列的“读对”与参考序列进行对比，寻找插入顺序的插入或缺失，③查询序列在 CNV 断点相交位置“分割读取”的对比，④拷贝数的“读取深度”方法是基于二倍体参考基因组中的期望偏差来推断的。基于组装的方法通常不适用于当前技术，因为由大多数下一代测序技术产生的短序列读数使其难以从头组装(特别是在重复区域)。剩下的三种方法都有优势和弱点。例如，读对允许检测不平衡的结构重排，例如易位和倒位，但是检测的范围受限于读取对的片段大小。分割读取提供精确的断点评估，但是也只能检测小的indel(通常<100bp,取决于读取长度)。读取深度方法可以检测较大的CNV,但是也更容易受GC 含量和比对质量的影响而产生偏差(更详细的评论可以在参考文献中找到)。因此，我们推荐一种检测策略的组合(图4-1)。一个高分辨率芯片也可以并行运用于CNV 检测；相同的数据也可以用于评价从WGS 检测的CNV的特异性和灵敏性。因为在基因组的重复区域对齐读数很难，经常会导致假阳性检测，所以我们建议从分析中删除那些片段(图4-1)。
罕见变异的确认
由于新生变异很少受到进化的约束，所以通常认为其比遗传变异更有害，因此它们在优先次序中被加权。但是遗传数据也支持常染色体遗传因子同样起到重要作用。迄今为止，ASD的常染色体遗传突变的全基因组研究主要限于隐性遗传模型。但是由于新的罕见变异在人群中不断增加51-53,我们还应考虑在单倍体不足模型下累积有害变异的可能性。同样，基于ASD 中男性与女性性别偏差为4:1以及近期 X 连锁形式 ASD 和智力残疾的研究进展32,54,553,从未受影响的母亲遗传的雄性中的X 连锁突变也需要考虑在内。

第4章自闭症的全基因组测序：临床转化    57

当评估遗传变异时，那些变异的群体频率可以用作过滤参数把可能有害的改变(其在频率上是罕见的)从很可能是良性的变异中(在频率中更常见) 区分出来。群体变异数据库如dbSNP 或1000基因组项目可用于这种比较。由 NHLBI(NHLBI GO Exome测序项目)支持的外显子组变异服务器的数据也有参考作用，但是队列中的许多受试者有发育障碍，因此不能作为理想的对照。对于我们的WGS 分析，我们把一个罕见变异定义为不存在于dbSNP 和 1000个基因组项目数据库中的变异。而一些研究者使用了频率取舍阈值作为标准(例如具有<1%小概率等位基因频率),这增加了需要跟进的潜在候选变异的数量。
包括功能丧失(LoF) 突变(无义，剪接位点和移码突变)在内的罕见有害变异和破坏性错义突变在我们的分析路径中处于首要权重。顾名思义，LoF 事件对基因的影响是非常明确的。相反，错义突变的功能效应可能不那么清楚，用于预测功能影响的计算机预测工具并不总是正确的56。为了增加灵敏度，我们总是使用至少两种预测算法，并且只对由这两个程序都产生的变异结果进行验证(SIFT 和 PolyPhen-2 是最常用的)。最后，我们建议只考虑那些预测的在已知的ASD 风险基因或途径中致病性错义突变来验证(详见下文)。
医学分类
为了评价所选择的遗传变异体与ASD 医学相关性，如图4-1所示，我们制定了以下评估流程(也参见图4-2):①预测变异是否可能对基因的剪接和蛋白质产物的功能性质造成有害影响；②在群体数据库中评估预测有害变异的频率；③受影响的基因与已知 ASD 候选基因进行比较；④使用在线孟德尔继承人 (OMIM) 数据库评估家庭中的分离和与风险基因的关系，⑤通过与小鼠基因组信息学(MGI) 表型数据库比较来评估功能相关性。步骤①和②已在前面的章节中讨论过，我们在这里详细说明步骤③~⑤。
我们分析用的是定期更新的专家注释的ASD 风险基因列表4。其他潜在的ASD候选基因座/基因可以在网上的数据库找到，如自闭症染色体重排数据库(Autism Chromosome Rearrangement Database) 、AutDB 、AutismKB、自闭症遗传数据库(AutismGeneticDatabase)和来自西蒙斯基金会自闭症研究启动计划(Simons Foundation Autism Research Initiative)的基因数据库。已记录的神经发育/行为表型的人或小鼠，其携带罕见有害突变基因的功能可以从人类表型本体论(HPO) 和小鼠基因组信息学(MGI) 数据库中检索出来。还可以通过可用的在线资源提供的信息评估基因的遗传模式。对于人类表型而言，0MIM 条目的数字注释可以用来确定遗传模式。 OMIM号码以1开头的表示常染色体显性，2表示常染色体隐性，3表示X 连锁。对于小鼠表型，可以基于与感兴

58       剖析ASD的遗传结构

趣的表型相关的基因型推断遗传模式：常染色体杂合基因型为显性的，常染色体纯合子基因型为隐性的，在假常染色体区域外X 染色体上的人类直系同源基因为X 连锁。
经过全面的评价，如上所述，携带有害突变的基因分为：①已知，②新型或 ③候选ASD 风险基因(图4-1)。在我们的研究中，携带 ASD 风险基因突变的 ASD受试者分为两组，一组用于随后的强调临床遗传学的临床评估，另一组用于药物治疗和试验的可能性招募。最后，牵涉基因在文献搜索中可以优先搜索，因为这些涉及的基因备受研究者关注。关于医疗分类的决策过程的细节在参考文献中有讨论。

ASD 全基因组测序在诊断和治疗方面的影响

在我们最初发表的试点研究中，我们已经用上述工作流程对一组家庭中至少有一个ASD孩子的WGS数据进行了分析8]。在这里，我们总结了一些具有附加详细信息的案例的研究结果，以及在家庭管理中如何使用这些数据。
揭示ASD 的临床和遗传异质性
多重证据表明复杂的遗传因素在ASD中的重要性(染色体异常，CNV,in-del,SNV) (参考文献中综述)。同时，详尽的临床表征揭示了ASD的高度异质性，从轻度的Asperger 病症到与严重智力障碍、癫痫及其他医疗问题相关的更复杂的表征。我们以及其他人发现新生变异是致病因素的同时，我们也强调罕见的常染色体和X 连锁遗传变异需要在家族中进行研究，因为ASD的遗传因素是显而易见的。根据这个设计思路，我们确定变异在50%所研究的家族中具有潜在的意义，或者是因为他们与ASD 个体临床综合征的关联，或其与 ASD和/或相关障碍，如智力障碍，或医疗共病，如癫痫发作的关联。一些检测到的突变可以推断是有致病性的和/或可能对于先证者或家族的临床管理或遗传咨询有意义。其他突变在疾病中的作用则需要在医学文献中密切关注。
促进医疗管理决策
一个男孩患有ASD, 并且他的杜氏肌肉萎缩症(DMD) 基因中发现有害突变，提醒临床医生对他进行肌营养不良症的检查，肌营养不良症是一种与进行性肌肉萎缩和心肌病相关的疾病。最近的发现提供了确切证据表明 DMD 的确是一个ASD 风险基因。在另一个不相关的先验者中，WGS 在 KAL1中检测到新的突变，一种X 连锁基因占卡尔曼氏综合征约10%,虽然可能与

第4章自闭症的全基因组测序：临床转化    59

ASD不直接相关，但一般医疗管理可包括激素治疗以引发青春期。在另一个家族中，一个先证者和他的父亲的CHD7中检测出有害突变，这表明他们被评估为CHARGE 综合征61,62]。在罕见的卡尔曼氏综合征病例中也发现了CHD7 突变，其中像CHARGE 综合征就具有功能感觉损伤和性腺功能减退63]。也许关于ASD最值得注意的就是约30%的CHARGE 综合征个体也归属于ASD。在SCN2A,CACNA1C和 EHMT1中携带突变的家庭应评估癫痫、蒂莫西氏综合征和 Kleefstra氏综合征各自的特征。这些个体，连同据报道表现有 ASD症状VIP突变的同胞携带者，也应该参与ASD 和/或相关神经发育-精神障碍的全面评估，并进行相应的治疗。
提供潜在的药理线索
研究中报道的遗传变异也突出了潜在分子靶点药理干预和ASD的个性化治疗方法。例如，在CAPRIN1/AFF2 和SCN2A基因中的个体突变识别出携带者来作为药物试验的潜在候选者，使用mGluR5/GABA A或 GABA A受体的变构调节剂，改善了小鼠中的自闭症样症状。
基因组覆盖率的提高有助于诊断率
关于测序，我们使用我们的方法检测到比以前在ASD 外显子组项目中发现的更高的新生变异突变率[24-27】,这可能是由于WGS能够更一致地捕获整个编码区。我们也注意到WES 对在此研究中WGS发现的新生变异和临床相关突变的捕获率不足11%,虽然这可能取决于使用的捕获方法和实现的覆盖率。正如在我们的原始文章中详细讨论的，WGS 展示了更均匀的覆盖，而WES存在更多的不一致性分布覆盖[8。在X 染色体上观察到甚至更高程度的覆盖差异，结果显示WGS覆盖的注释外显子比WES能够多至少17.5%(超过编码的 5.7%)。考虑诸如基因剪接位点的区域时，这种覆盖差异甚至更显著。最近的一项研究报告中指出WES变异检测的检测率不足WGS的11%[69。

使用全基因组测序的自闭症临床遗传研究的未来方向

WGS 将比其他用于确认和预测诊断的技术鉴定出更多的遗传变异。在图4-2中，我们修改和更新了我们早期对CNV 的研究想法,现在包括所有

60          剖析ASD的遗传结构

遗传变异以及如何评估这种关于与 ASD 相关的“基因组”和“医疗”问题的新数据。初始应用很可能发生在具有ASD 病史的家族中，因为早期鉴定可以提示诊断和缩短诊断路径，从而让儿童从早期干预中更充分地受益1。在ASD 易感基因中具有新生突变的儿童的家族中，复发风险可能与一般人相似，但是如我们先前已经证实的结论，我们也需要考虑性腺嵌合问题8,12,18]。ASD 候选基因中罕见遗传变异的存在，以及男性X 连锁突变都可能会增加风险，因此我们建议增加发育期监测以便更早识别。
解决变异的不完全外显率和可变表达
从该工作流程分析中选择的遗传变异是极为罕见的，因为它们不存在于数千个非ASD个体中。由于这些突变是家族的隐私，基因型-表型相关性只能从该家族关系紧密的家族中表现出来，特别是有遗传变异的家族。我们讨论的所有常染色体遗传的有害突变都存在于ASD 候选基因中。对于一些杂合子突变，其建立的作用机制可能是单倍体不足。因此，这些基因可能会以显性方式表达，在一些情况下可能具有不完全外显率和/或可变表达力。虽然每个人都是一个携带有数百种有害变异的载体，但是许多以前被记录为隐性，因此不知道是有致病性的。最近对179个个体的基因组中罕见有害变异的研究显示，应用非常严格的过滤参数后，很少有已知的致病变种在与显性疾病相关的基因中被发现，反而与晚发性或无明显疾病表型相关联71,表明在已知显性基因疾病中发现罕见的有害突变是不常见的。事实上，我们研究中的一些家庭显示了表型与相关已知结局变异的相关性，但是为什么一些携带者不受影响，其原因仍有待确定。需要进一步变异的群体遗传和功能研究以及携带者的重新评估来解决这个问题。
提高全基因组测序CNV检测质量
WGS涵盖整个基因组，因此它在遗传变异检测中应该能够提高基因组覆盖。然而，从WGS数据检测到较大的indel 和 CNV仍然是一个挑战50]。使用基于读取深度的方法进行CNV 检测，我们发现多达88%的检测可能是假阳性。根据我们的经验，目前单独的高通量测序不会产生完整的变异目录，事实上，不同的方法可能产生不同的结果41]。在一项研究中，我们通过多重算法检测来自WGS 的 CNV 检测的性能，我们发现检测率与高灵敏度和良好的确认率(69.5%)相关，并且分裂读取和配对末端定位可以精确地确定变异的大小。然而，染色体的增益鉴定仍然具有挑战性，因为检出率随着片段从中等到较大的递增而降低，尤其是在DNA 的重复区域。由于比对问题，短读不适合捕获穿插和串联重复基因座的变异。一种解决方案是生成多个不同插入长

第4章自闭症的全基因组测序：临床转化    61

度的文库；小插入片段分布的小型文库在检测较小的变异和局部断点有优势，而大型文库在发现较大的变异方面则更优化。随着技术的进步，现在可以获得更长更准确的读数，这将有利于更准确进行比对和发现变异。当我们测试其他现有的/新的和改进的注释算法时，尚未发现的在基因和非基因间隔中的 indel 和CNV也可用于ASD家族中基因型和表型的研究。
分析基因组中的非编码区
尽管非编码区构成基因组的近99%,大多数测序研究迄今仅关注基因组的编码区。在那些尝试过的少数WGS非编码变异数据分析中，人们仅研究了新生变异，并且很少强调解释它们对研究受试者的影响。解释在非编码区中发现的遗传变异的临床意义仍然很困难，因为这个广阔的基因组区域仍有待更好地解析。然而，ENCODE 项目的最新发现表明，80%的非编码区确实具有功能73】。此外，一些基因组研究已经确定了ASD的突变个体中的非基因片段 DNA[³7,383和非编码RNA。这些确定的变异中一些可能是通过改变基本元件的序列来调节附近基因的适当表达。能够预测一些假定的调节位点如转录结合框架的生物信息工具已经开发出来了75。然而，转录结合因子可以是组织特异性的，并且不同基因组区域可能存在差异。因此，评估和验证转录结合因子中DNA变化的影响需要高通量功能测定实现。未来技术的改进和测序成本的降低会通过增加全基因组测序的数目，提供丰富的用于交叉比较的变异数据，必将在很大程度上推动WGS数据的整体解析。

结论

WGS在 ASD 研究中已经彰显作用，诊断意义和临床效用应当随着更多未检测到的遗传结构变异体的发现和确定而增加。 WGS 数据验证了越来越多的 ASD中存在显著的临床和遗传异质性和多效性。随着更多的发展，WGS将成为用于ASD的 DNA诊断测试的首选方法。随着更多的来自自闭症和对照人口家族的基因组测序，解读可疑病因学遗传变异将会越来越容易。我们预计初期许多新的WGS数据将主要来自实验研究，而后实现临床诊断测序，来替代目前临床使用的芯片法进行自闭症评估。

本章要点

● ASD具有高遗传基础，高达90%的遗传性。
● 许多ASD 风险基因可以通过先进的基因组技术进行鉴定。

62       剖析 ASD的遗传结构

●每个ASD 风险基因仅在小于1%ASD 病例中出现。
● ASD风险基因有丰富的神经元突触和发育功能。
●使用WGS 技术能可使临床相关变异在多达50%的ASD 病例中检测到。
●深度评估WGS 数据可以提高ASD 病例的临床诊断准确度。
● 最佳的做法是通过完整大小的遗传变异谱对新生突变和遗传变异进行研究。
●WGS数据可以通过评估家庭的临床信息和使用在线遗传和/或表型数据库来辅助解读。
● ASD的临床和遗传异质性支持个性化医学的应用。
●WGS促进包括遗传咨询和治疗选择的医疗管理决策。
●WGS可以提高基因组覆盖率并可能检测到与ASD 相关的所有遗传变异。
●许多临床相关变异显示不完全外显率和可变表达，这个问题应该在未来研究中解决。
●WGS的当前CNV 检测仍然不够完善的，应该努力改进CNV 检测的策略。
●应该制定新的战略来描述基因组的非编码区变异的作用。

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第 5 章

整合性非常规数据分析方法对自闭症遗传学研究的影响

Zohreh Talebizadeh,Ayten Shah 丁信嘉译，丁岩孔学君校

摘要
基因组学技术的发展给研究者提供了前所未有的机会来加速发现自闭症的遗传病因。文献中所述的这个明显趋势是：把最先进水平的科技应用到自闭症研究中的最好见证莫过于从文献中看到从基因为中心的研究到全基因组手段的明显趋势。这些技术渐渐从联动扫描、单基因、全基因组关联研究、拷贝数据变化的时代发展到新一代的整个人类基因组的测序。然而，除了识别一些致病基因和有限的可重复性的发现外，其余的研究主要致力于不断增长的潜在的等待重复验证的自闭症候选基因。这一出人意料的结果现在已经成为自闭症基因发现到诊断测试和治疗选择进程中的另一个挑战。在这一章，我们着重介绍一些使用整合性的非常规模型方法得到的很有前景的实验结果和例子来展示加速发现自闭症遗传原因是如何实现的。
关键词：自闭症；整合方法；基因；表观遗传学；基因调控过程；性别差异；表型分层；系统生物学；交互作用体。

前言

各种各样的易感基因和染色体异常和自闭症谱系障碍(ASD)有关，但大多数发现要么没有成功重复，要么证实对发病只有轻微影响。虽然人们普遍认为多基因(和环境因素)可能是自闭症的病因，有多少遗传易感性因素参与其中并且这些因素如何累积而导致自闭症特定亚型的问题仍然有待解决。自闭症基因研究中重复率低的主要因素之一是缺乏把研究结果进行足够归纳和

第5章整合性非常规数据分析方法对自闭症遗传学研究的影响    69

整合。解决这一问题的一个方法是采用整合性系统生物导向的研究手段。为了证明这种方法的重要性，这里我们讨论了大量成功应用过的方法。所选的例子描述了自闭症研究中整合不同层面的遗传和表观遗传因素、性别差距、自闭症表型以及生物信息学流程等，从而连接这些点，预期实现自闭症特异性的系统生物学网络的构建(例如，自闭症交互反应)。

全基因组研究

据报道许多自闭症候选基因和泛基因组相关性研究(GWAS) 以发现常见的遗传风险变异为目标，但都无果而终。例如，GWAS对两个单独的数据集进行研究，包括家系(n=943) 和病例对照研究(受试者分别为1204和 6491),最初并没有检测泛基因组的关联性。然而，应用de Bakker等推荐的分析变量法，对这两个独立的数据集进行分析，显示位于5p14.1 的 rs43070599 SNP具有泛基因组学显著意义2]。Ma等人也报道过5p14.1SNP与自闭症的相关性3。
尽管复制5p14.1 关联性是很鼓舞人的，但剩下的挑战就是去发现这个染色体在自闭症病因中的潜在作用。相关的在5p14.1上的单核苷酸多态性不驻留在已知基因内；因此，评估潜在的候选基因(如钙粘蛋白基因)没能提供结论性的结果。虽然传统的候选基因筛查并不富有成果，利用生物信息学和表达研究相结合的方法，Kerin等发现大量没有编码的核糖核酸从这个与自闭症有关的区域被转录4]。令人惊讶的是，这个产物是由一个高度相似的假基因编码(MSNPIAS), 和位于X 染色体上蛋白质编码基因(MSN) 高度相同并反义。携带自闭症相关的rs4307059 等位基因的个体在这假基因的表达上有所增加。MSNP1AS可以与位于X 染色体互补的副本绑定导致MSN的下降。这种创新方法阐明了遗传因素相互联系的本质和替代元素的关键作用，如和未编码的核糖核酸和假基因在填补空缺并揭示这种复杂情况的潜在致病机制。
Weiss⁵等采取结合传递不平衡测试(TDT) 和病例对照的方法进行另一个大的全基因组关联研究，但没有找到和报告中在5p14.1SNP 位点关联的证据。但是，他们的研究提供了一个5p15 染色体上SEMA5A 附近基因间SNP 的相关证据。与对照组相比，初步的基因表达研究显示SEMA5A 在淋巴母细胞样细胞系(LCL), 自闭症的血液及大脑样本中低度表达5-6。然而，一个与 5p15 SNP相关的低小等位基因频率(MAF<0.05) 表明除了这一个侧翼基因的表达还可能包括了对自闭症的敏感性。
后来，自闭症基因组计划(AGP) 研究组汇集了50多个北美和欧洲的中心，进行了一项包括1558个三口之家的最大的家族式全基因组研究7。然

70    剖析ASD 的遗传结构

而，无论是5p14.1还是 5p15 位点都没有找到相关证据。但是发现位于20p12.1的一个SNP(rs4141463 MACROD2 基因内区)符合了全基因组关联的统计学意义。然而，后来一个独立的病例对照研究却无法重复这一发现8。这种低重复的问题反映了广泛的ASD异质性，这个问题在招募来自不同遗传背景的受试者(如不同种族)中更为突出。
后续结合了表达和基因分型数据集的eQTL 计算方法表明，SEMA5A 基因调控网络中的罕见变异，包括以前的自闭症的候选基因和区域，如MACROD2, 可能会影响自闭症风险。这种整合方法提供的证据表明，相同的通路可能同时含有罕见的和常见的自闭症易感遗传变异9。因此，不同类型的易感性因素的集中评估可能检测到之前分散的发现之间潜在的关联。
最近的研究为解读全基因组研究数据和理解基因架构的复杂性，如顺式调节基因表达SNPs, 提供了新的见解。这是通过对表达数量性状(eQTL) 和甲基化QTL(mQTL) 相关组织的富集分析来实现的10,11。Davis 和其同事¹2使用现有的来自AGP的 GWAS数据 7 ,Gamazon 等11提供的大脑全基因组表达数据及SNP 和CNV 注释数据库。这个研究小组采用了以前用于双极紊乱的方法来测试GWAS数据高度易感性自闭症SNP 中的eQTL(在大脑和LCL)。这种方法显示在GWAS数据中与自闭症高度相关的单核苷酸多态性中大脑 eQTL的整体富集现象(但不是LCL eQTL)⁷。应用基于注解的方法[¹2]还发现了三个自闭症中高度暗含的基因，PANX1、PANX2 和 SLC25A12,其中两个 (PANX2 和 SLC25A12)之前被报道在自闭症中以不同形式表达。这种类型的研究方法表明了整合方法能提高神经发育障碍GWAS研究能力。
除了上面所讨论的对易感因素提高功能性分析的必要性，另一个检测全基因组关联基因/等位基因的障碍是其他风险因素的影响(即基因、性别和环境因素),需要评估多元素间的交互作用15]。因为自闭症不同性别发病的显著差异，性别是在全基因组研究中需要评估的一个次级因素。为提高自闭症全基因组研究的检测能力，Lu 和 Cantor¹5 对来自Autism Genetic Resource Ex- change(AGRE)组织的990个多发性自闭症家庭进行了联合相关测试16,并将性别作为数据分析的一个风险因素。这种方法的原理是研究潜在性别特异性的ASD风险等位基因的外显率。家庭按基于性别影响的受试者情况分成两组[即只有男性(MO) 和包括女性在内(FC)] 结果显示两个关联SNP 具有全基因组的显著意义。这两个易感性内在等位基因，rs6683048(RyR2内)和 rs1740138(UPP2内),在两组均显示过度传递(74%和75% MO,66% 和77% FC 的家庭)。虽然，在两组中观察这种关联，但在一个标准的家族关联测试中并没有发现关联(例如，不考虑性别因素)。
最近的基因组学技术的进步可使用全外显子组测序的基因组高通量测序

第5章整合性非常规数据分析方法对自闭症遗传学研究的影响    71

方法(WES) 对整个蛋白质编码地区测序。寻找罕见的新生功能缺失(LoF) 突变已经成为大多数WES报告的中心点。然而，考虑到疾病的复杂性和多基因的参与，除了LoF突变外，其他类型的新生突变以及遗传事件也需要评估，但他们通常在传统的自闭症高通量测序方法研究中被忽略。为了解决这个关键的问题，He 等17开发了一个叫做TADA的整合统计方法来研究传递和新生变异的关联性。这种方法得到基因特异性的P 值并利用LoF新生突变与遗传变异结合去识别自闭症风险基因。这种方法还对家族数据和病例对照研究的数据进行整合，这在传统的分析方法中是不可能的。与常用方法相比，TADA 方法对之前发表的近1000个三口之家ASD和来自病例对照组的2000个受试者[22高通量研究数据分析显著性地展示了该方法的检测能力(如，评估新生LoF) 。此外，一些用使用整合分析模式检测到的具有显著意义的基因，若不结合新生传递和病例对照数据是不可能得到的。这个分析测序数据质量的提高说明，除非与整合方法一起使用，否则即使用最先进的基因组测序方法 ( 如WES)也无法揭示自闭症的全部复杂的发病机理。

自闭症中的性别差异

自闭症的男性较多，男女比例至少4:1。然而，这种性别差异的生物基础没有被完全阐明。X 连锁基因和表观遗传因素的作用如印记和X 染色体失活是目前提出的最著名的假说24]。其中一个首次提出的解释男性自闭症风险增加的理论指出X 染色体在男性中的保护作用25]。一个早期的猜测是ASD可能是一种X染色体疾病，在这种情况下，女性会由他们的第2个X 染色体提供保护机制26]。尽管现在的证据倾向于ASD多因素性的遗传(排除了X 染色体的传递方式),产前性激素影响自闭症特征,一些补偿效应机制通过性染色体基因剂量或性效应机制激素可能仍然存在。其他对关于X 染色体理论的考虑是X 染色体相关的小分子核糖核酸(miRNA) 。高达10%的人的所有miRNA都位于X 染色体而不是常染色体，还有它们在免疫功能中的作用，支持另一个新的假说(即在疾病病因学上，女性的免疫优于男性)3¹。因此，X 连锁miRNA与自闭症性别差异相关的程度需要进一步评估。
另一个对自闭症中性别差异的解释是男性平均需要更少遗传风险因子以达到一个同等的破坏阈值。这一发现却没发生在多元家庭，这意味着性别和损伤严重性在单一家庭和多元家庭存在潜在的差异。由Szatmari[34等发起的研究通过关注重复的行为对多元化家庭严重自闭症的特征是否有性别差异进行测试(分为MO

72 剖析ASD 的遗传结构

和FC) 。这项研究表明在 FC 家庭中自闭症男性亲属比MO 家庭更受影响。这一发现也得到了最大的基于自闭症双胞胎(192对)受试者的研究结果的支持35]。这些观察在一个最近的研究中得到重复，进一步支持上述女性对自闭症的保护作用的假说。
虽然观察到的性别差异因素仍然需要阐明，新的证据表明在自闭症基因研究中考虑性别因素将提高检测能力。这在SNP 和候选基因关联研究以及染色体异常的检测中有所体现。例如，在染色体16p13区的拷贝数变化经常与包括自闭症的神经发育障碍有关。对46例染色体16p13 基因拷贝数异变的检测(删除和复制)显示出性别偏向的影响，只在男性有显著富集的基因拷贝数异变，但女性中未发现[³。这一发现表明，在研究自闭症相关的CNV 潜在病理机制中考虑到性别差异是至关重要的。
通过对大量单元家庭中得来的全基因组新生 CNV 数据的网络方法分析³2],Gilman 等人38验证了女性在潜在的致病遗传紊乱方面强于男性的假设。这种分析支持两种贡献机制：
①女性基因拷贝数异变明显高于男性(分别大约为10基因/CNV 和 3 基因/CNV)
②女性受到基因拷贝数异变影响的基因对整体网络集群得分的影响比男性要大。
除了基因拷贝数异变，性别差异的影响在其他自闭症的遗传学研究包括连锁和GWAS中也有所体现。在一个早期的用于性别差异的全基因组扫描研究中，这个连锁研究在受性别影响受试者基础上进行(MO 和 FC 的家庭),确定了男性连锁高峰。在这个连锁研究中应用性别分组的重要性还进一步体现在原来未按性别分组的基因组扫描方法未能把自闭症队列和一般人群区分开来40]。运用性别作为另一个多元自闭症家庭GWAS的风险因素提高了研究能力并检测到了显著的性别特异性的全基因组基因变异。
性别效应不仅增加了对自闭症易感因素的检测能力，同时也改善了自闭症的风险评估模型。Carayol等。

表型分类

自闭症通常伴随着其他症状或疾病，这些同时发生的症状可能作为生物标记物来帮助识别在ASD 和非ASD 表型的亚群中同时发挥潜在作用机制的

第5章整合性非常规数据分析方法对自闭症遗传学研究的影响 73

因素。这些并发症状已用于个体分类用来研究遗传连锁、关联和突变筛选。这些ASD 亚型分类的大多数的结果已经被重复，进一步证明分类方法在了解这个异质性疾病的遗传病因上的应用价值。通过关注在自闭症的案例中的并发症状(比如，巨头畸形和胃肠道功能障碍),研究人员发现了2个高度可重复的自闭症致病基因(PTEN 和 MET)。
除了共病外，行为分析也可以减小自闭症现有的表型异质性。因为自闭症患者在一个广泛的行为中明显不足，解决表型异质性比基于一个领域严重程度的个体分类方法需要更多的包容性的方法，例如语言障碍或非语言沟通。为了解决这个问题，Hu 和 Steinberg⁴7通过超过100ADI-R 分数大范围症状的多个聚类方法，确定了代表不同的表型的自闭症的四个亚型。ASD的异质性也在家庭水平上反映出来，因此，在多元家庭自闭症的症状在受影响的兄弟姐妹之间可能会有所不同。因此，为了解决家庭之间与内部异质性的问题，我们通过整合多元家庭ADI-R分类[47开发出了一个多步骤的分类方法[48。
为了测试该模型检测连锁扫描的功能，我们对已发表的392个多元ARGE 家庭现有的SNP基因分型数据进行重新分析。受影响的个体ADI-R亚表型通过使用一个多步骤的分类过程来产生组群特异性的SNP数据集。再通过应用深度分类方法的分析系统把原始异质性自闭症谱系数据进一步过滤成同质性数据集。首先利用ADI-R聚类分析，其次是删除亚表型不一致的兄弟姐妹，最后分离MO和 FC的家庭[48。
没有位点达到合并后未分类的队列统计学意义(n=392 家庭)。然而，两个表现最严重语言障碍的ASD亚组(n=232 和63个家庭)的染色体22 q11 和13q21具有显著的关联分数(即，LOD 得分大于4)。值得注意的是，13q21之前与自闭症语言障碍有关，并且22 q11 已分别与自闭症或语言障碍相关联。把两个分类的FC 子集结合起来(n=23 个家庭)做5p15 号染色体的连锁分析表明连锁关系(LOD=3.5), 这个结果重复了之前对FC 队列的结果49。之前报道的联合自闭症FC 的队列的有关5p14-p15 SNPs²,5结果也得到证实。
有趣的是，对所有FC 的家庭进行类似但没有应用ADI-R 子类型化分析 (n=166), 就没有检测到与染色体区域的关联。我们在给定的ADI-R 分类后的 FC 组的结果不仅证实了先前的连锁提出的有趣模型中其他自闭症风险因素的发现。
这种整合方法解释了当ASD的异质性适当的样品分类所减少时有助于提高显著性关联的可能性。它也提供了在基因扫描层面对家庭间和家庭内异质性分析的第一手证据，反映出共享的和独特的自闭症人群的基因组成。家庭

74       剖析ASD的遗传结构

间和家庭内异质性是在多元家庭全基因组筛选中另一个被忽视的重要因素。

网络分析

研究人员对开发通过计算工具和数据挖掘系统来预测基因/环境或基因/ 基因相互作用从而评估实验结论的自闭症网络模型的兴趣已经有十余年。在一关于这个话题最早的论文中501,多个生物信息学工具，包括Pathwayassist软件(Ariadne Genomics,Rockville,MD)和 ResNet 数据库应用于被早期广义基因连锁研究所发现的定位自闭症候选基因40]。数据挖掘研究的目标是优先考虑候选基因，预测基因相互作用的途径，并确定生物学上有意义的自闭症的候选基因。此后，更广泛的分析工具被开发并用于广泛的自闭症基因数据分析，这里将集中讨论其中一些工具。
Lee 等人51〕基于7个被普遍报道的自闭症表型特征结合多个自闭症基因数据(如GWAS,CNV 和基因表达)进行一个整合自闭症基因网络分析。这些与7个限制表型相关的基因被从数据库(Ingenuity,GeneGo,HuGe navigator)中提取。一种新型的以CNV 为中心节点的网络分析方法，以及GWAS 和表达数据被用来识别自闭症中潜在的调控网络。
之后，自闭症特异性的罕见和综合征性的候选基因被用来构建一个基于通过整合生物信息学方法功能和表达分析得到的复合参考检测图52]。对大脑特定区域自闭症基因图谱预测是通过创建一个ASD 候选基因参考组的功能检测图和 DAVID 分析的表达图来实现的。这个功能性检测图确认了在ASD 突触传递中三个关键生物过程。这样一个预测基因图可能促进自闭症相关基因数据的优化。
Poelmans等。这个发现通过外显子组测序、CNV、基因表达研究(基因和microRNA)以及转基因动物研究得到了进一步证实，从而确认了三个ASD有关的信号通路网络。此外，这个生物信息学和文献分析数据集成研究显示罕见和常见的ASD 有关的遗传变异的重叠。
最近，为研究自闭症多元性的本质，Zeidan-Chulia 和其同事55开发了一种联合全面文献检索和系统生物学计算方法。他们的目标之一是确定与疾病密切相关的主要生物过程和主导因素(遗传和/或环境)。这样的计算机模型可能提供一种用来识别潜在的遗传和环境因素以及它们在自闭症中的交互作用的方法。
疾病相关基因的生物相关性需经功能实验来证实。追求富有成效的自闭症基因功能研究的挑战之一是了解大脑中的相关基因时空表达模式。要解决

第5章整合性非常规数据分析方法对自闭症遗传学研究的影响 75

这一问题，Willsey等5⁶建立了基于可信度高的自闭症外显子组测序和全基因组测序研究的基因并使用公开可用的人类大脑的时空转录组数据57]作为底物而构建的共同表达网络。这样的集成分析方法为通过指导何时、何地以及哪种细胞类型应该作为候选基因被研究[5⁶来识别ASD 有关突变的病理生理机制提供了一种潜在的基础。

蛋白质相互作用网络

采用综合方法来深入理解人类疾病的病理生理的重要性通过引入一个蛋白质相互作用网络新概念而在基因领域进一步得到体现。这个概念是指交互生物系统与复杂的蜂窝网络，并作为下一步预测基因型-表型相关的结果58]。在蜂窝系统网络中有不同类型的蛋白质相互作用网络，包括代谢、蛋白质相互作用、基因调控系统和网络功能连锁(转录表征图，表型和遗传相互作用网络)。为了避免简化复合系统而失去每个环节的功能影响，评估联合网络是至关重要的。因为细胞内各类生物网络异常错综复杂，蛋白质相互作用定位还未彻底完成。然而几个生物模型的图谱已完成，人类的网络图谱绘制也在进行中58]。
正如预期的那样，蛋白质相互作用网络的概念正如蛋白质相互作用网络所显示的那样在自闭症研究社区开始得到关注[59。这样的努力可以通过合并其他网络像microRNA 调控间的人类蛋白质相互作用网络而得到进一步扩大【601。在自闭症基因研究中运用如本章所述集成方法将为推进自闭症蛋白质相互作用网络重建提供额外的知识库。

未来方向

尽管越来越多的人意识到多元化的自闭症体系结构并意识到需要考虑性别差异和表型异质性，这些基本要素仍然在研究设计和研究方法中经常被忽视。很大一部分的研究经费已经用于产生快速增长的不同类型的自闭症基因组数据。自闭症启动计划即Autism Genetic Resource Exchange(AGRE),SimonsSim- plexCollection(SSC),NationalDatabaseforAutismResearch(NDAR)⁶1和协会如 AutismGenomeProject(AGP)andAutism Sequencing通过从患有自闭症受试者收集表型数据和持续的基因组数据(如基因型，CNV, 基因测序和表达)为研究团体提供了宝贵的资源。
从生成新的数据到重新评估现有的表型和基因数据以及开发新的整合研究模型是一个长期的转变，将加速发现先前未被发现的自闭症的风险因素。

76          剖析 ASD的遗传结构

如果整合基因组数据后进行重新分析，过去建立起来的概念如性别差异、疾病和表型异质性对加速重复发现结果、亚型检测和生物标志物识别以及促进以证据为基础的、更有效的自闭症治疗策略的发展具有巨大的潜力。

本章要点

●多种基因和环境因素可能导致非寡基因形式的自闭症，这需要对潜在的遗传和表观遗传促成因素的累积评估。
●整合方法(即利用两个或两个以上的表型和遗传因素以及生物信息学和数据挖掘渠道)对发现生物相关和复制发现将有力地推动自闭症基因领域的发展。
● 本章所讨论的例子说明如何通过运用集成系统生物导向的研究方法来对多个分散自闭症研究结果建立相关性。
●异常基因调控过程，如非编码核糖核酸、可变剪接和DNA 甲基化可能在发病机制复杂的条件下发挥至关重要的作用。现有和正在进行中的大规模的自闭症基因测序和表达数据也需要把基因调控的因素考虑进来以进行分析。
●考虑到基因与表观遗传机制评估对累积的和自闭症中多因素之间互相作用的影响，需要设计综合的研究方案和数据分析策略去揭示多因素形式的 ASD 发病机制。

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第5章整合性非常规数据分析方法对自闭症遗传学研究的影响 79

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第 6 章

使用基因通路分析构建 ASD 的遗传分类

GursharanChana,ReneeTesta,PiersGillett,
DanielWilliams,ChadA.Bousman,DanielaZantomio,
IanP.Everall,ChristosPantelis,EfstratiosSkafidas
丁信嘉译，丁岩孔学君校

摘要
自闭症谱系障碍(ASD) 中的一些遗传研究已经得到与这种神经发育障碍相关的单核苷酸多态性(SNP) 和拷贝数变体(CNV) 。然而随着研究的进展，证据表明这些遗传改变可能只出现在特定家族或群体，而其在较大群体中的外显率则稍低。这导致研究人员提出了一种假设，ASD 的遗传学可能是由共同的遗传变异的加性集合组成，当彼此组合时能够解释更多疾病的遗传性。除了ASD遗传学的更全面的观点外，这些改变对ASD 临床表型的认知的影响也必须考虑。本章首先总结了与ASD个体诊断或分类相关的非遗传学和遗传学发现。然后我们讨论使用基于我们最近发表的结果而建立基因通路分析为基础的ASD基因分类方法。这些报告包括了控制人口分层、ASD 风险和保护机制的战略。最后，我们将讨论如何将这种方法应用于其他神经精神障碍和提高分类准确性。
关键词：遗传；自闭症；通路；诊断；分类。

前言

自闭症谱系障碍(ASD) 是一组异质性的终生性神经发育障碍，发病率为 1%～3%↓ 。ASD 是一种广泛的诊断分类，包括自闭症、阿斯伯格病(AD)和未指定的广泛性发育障碍(PDD-NOS) 。在最近的诊断和统计手册-5(DSM-5)

81

82          剖析ASD的遗传结构

以及国际疾病分类-11(ICD-11)的草案中，ASD 的核心特征被分为两个行为层面：①社会交际；②局限的、重复的行为和兴趣。此外，遗传研究揭示了ASD 的几种候选基因突变的显著证据，包括编码基因 SH3, 在 SHANK3的甲基化状态中具有调节异常的多个锚蛋白重复结构域 (SHANK)蛋白家族。其他基因座参与ASD的证据来自于5%～15%的ASD个体中展示拷贝数变异(CNV) 以及新生突变的研究11。个别地，这些基因和基因座的改变提供了强大的关联信号，然而，它们自己无法在数据分析或更大的队列中实现准确的ASD 诊断分析。这一结果使研究人员得出结论，ASD包括一组多基因和异质疾病与多因素病因。事实上，最近的一项调查估计，ASD 可能有400～1000个基因位点参与[¹21。根据其细胞和分子功能，这些基因的本体组合提供了一种方法，以集中观察ASD 风险基因，突出强调可能与疾病有关的关键途径。采用这种方法，很明显，许多不同的途径与 ASD显著相关联。这些途径包括突触和神经元活动、谷氨酸能功能、细胞黏附以及参与γ-氨基丁酸(GABA) 功能的基因和与其他神经发育障碍相关的基因。本章最初将提供对ASD分类的非遗传方法的概述，包括行为和认知的分析，随后讨论ASD的遗传学发现。然后我们将介绍为ASD 开发遗传诊断分类器的策略，并指出改进这些分类器的未来方向，同时考虑所研究人群之间和之内不同程度的种族差异。最后，通过调查它们编码的mRNA 和蛋白质将讨论验证和扩展ASD的遗传学结果的重要性。

ASD 的临床诊断

自闭症谱系障碍的诊断领域中存在许多挑战。目前还没有在不依靠具备临床专业知识的医生参与的情况下能够明确诊断自闭症(ASD) 的仪器或试验(心理学、行为学或生物学)¹3。然而，DSM-IV-TR14和最近的DSM-5[15提供了存在于具有ASD的关键功能障碍结构域的描述，包括社会障碍、重复和限制性行为和兴趣，以及最近识别的感觉处理障碍[16,171。一系列评估测量旨在识别这组临床和行为特征。这些测量一般被设计为允许临床医生(即儿科医生、心理学家、精神科医生、一般医疗从业者)计算“自闭症”得分，以便确定儿童是否满足ASD的标准。
可用的测量包含短的问卷评估，例如自闭症修改检查表(M-CHAT)、

第6章使用基因通路分析构建ASD的遗传分类 83
社会交际问卷(SCQ)、自闭症行为检查表(ABC)和社会响应性量表 (SRS),其被认为是缺乏 ASD 特征的特定行为。这些问卷包括原始指示、遵循一个指令、给父母看物件、社会兴趣、模仿和回应人的名字。这些行为可用来诊断区分有或没有自闭症或普遍发育障碍的幼儿。这种简要的行为检查表有时被发现是不足的，并没有为“更难诊断”的孩子提供深入评估。为了解决这一点，开发了自闭症诊断面试(现在修订：ADI-R) 。这是一个结构化的、标准化的父母面试，旨在通过社会关系、沟通和重复性限制行为的三个主要症状领域来评估自闭症的症状在儿童早期的存在和严重性。虽然这被认为是自闭症评估的黄金标准，但是长达两三个小时的就诊时间，除了依赖父母回顾性报告之外，意味着有必要对 ASD 评估进行额外的修订。缺乏临床医生与被评估儿童的相互作用是最突出的，因为先前的测量仅仅依赖于父母或护理者提供必要的信息来进行诊断。此外，对发育史的依赖和缺乏对儿童的直接面对面的临床评估意味着，如果父母或看护者不能很准确地提供儿童的发育史，或儿童没有表现出这些检查表上列出的“经典”特征性ASD行为，就可能会导致诊断的不确定性。此外，那些呈现混杂变量的患儿，如智力迟钝或发育语言障碍，使得评估极其困难或模糊。这对早期干预和获得需要诊断的政府资助会有影响。鉴于这些限制，ASD的床诊断的最新进展，自闭症诊断观察量表(ADOS)被开发出来。ADOS是一个半结构化的标准化面试，在30～45 分钟的面试中使用适当的社交和基于玩具的互动，在四个领域引发自闭症症状：社交互动，沟通，游戏和重复性行为。它将孩子置于几种情况下，强调社交和交际互动，并允许直接观察ASD症状。有四个模块，每个模块针对特定语言能力水平。
不管使用的行为测量如何，显而易见的是，在做出儿童的任何诊断之前需要一系列关键的评估步骤。这允许所有年龄和水平的儿童被评估认知和语言功能，因为这个过程可以根据需要的水平进行调整。首先，除了直接观察和与孩子的互动，详细描述儿童的早期发育进展和症状表现是必需的。考虑到父母的报告可能有偏见或没有提供足够的信息，从多个设置和来源收集数据是必要的(如学校、教师、家庭教师、家庭环境、父母)。自闭症儿童对他们的环境以及他们在评估期间提供的结构或支持非常敏感。因此，他们可以在不同的环境中表现出不同的行为。除此之外，对于总体发育迟缓或语言障碍所存在的认知、语言和适应性技能的评估是必要的。这可以由临床医生团队来执行，但是需要确保呈现出行为与另一种神经发育状况不一致。许多ASD 行为不仅仅针对自闭症，因此需要进行全面和广泛的评估，以排除替代诊断
诊断ASD的一个重要障碍是从出生到成年期间存在广泛的症状。据报

道，任何个体可以在一生中呈现特定的 ASD 样行为，但可能不会一直都明显26]。例如，在早期蹒跚学步时期观察到的重复的游戏行为可能无法从儿童早期看到，并且可能表现为一种局限性的兴趣。或者，一些儿童可能对新事件或社会情况没有表现出焦虑，并表现出对同伴友谊的兴趣，但随后在他们的家庭环境中表现出非常具体的必须遵守的行为惯例，否则会观察到显著的基于焦虑的行为。这些ASD 性状的非常特殊的性质取决于个体的特征及其发育阶段和年龄，这意味着对 ASD 行为的神经发育轨迹随时间的评估将对于 ASD的评估和诊断非常有用38]。如果我们能够开发ASD 个体从出生到成年的不同亚组中可能的ASD行为谱，我们将能够更具体地询问我们期望获得的每个可能容易被忽视的个体的行为、特征或性状。事实上，在一项前瞻性纵向研究中，Ozonoff及其同事(2010)的报告中指出，发生ASD 的高风险儿童在 6～12个月龄之间表现出明显的ASD 行为迹象，包括眼睛接触、社交微笑和社交的减少，与12～18个月28正常发育的儿童有显著差异。早期识别和识别新出现的自闭症特异性行为对早期发现处于危险中的儿童具有明显的影响。更好地了解ASD的发展轨迹将有助于诊断过程，通过告知临床医生不同年龄的预期症状表现，并通过更清楚地了解受影响个体随时间的预期发展，帮助家庭。
虽然映射ASD行为的神经发育轨迹将是无价的，但作为诊断ASD的主要来源的行为分析和鉴定仍然存在持续的挑战。例如，所讨论的行为在特定的评估时间可能不明显，或者行为可能被误解、错误标注或未被识别。鉴于这种模糊性，支持临床行为诊断(例如生物标志物)的其他手段将有助于促进评估过程并增加可用诊断工具的可靠性。

ASD 中的遗传研究

单基因疾病与ASD 发病率增加
有关ASD的遗传基础的强有力证据来自于单基因疾病，其显示出比一般人群显著更高的ASD 发生率。这包括脆性 X 综合征(FXS) 、Rett 综合征和结节性硬化症。这些障碍与5%的ASD 病例相关41]。在这些疾病中，FXS是遗传性智力障碍的最常见原因，其中40%～60%的男性患者和20%的女性患者满足ASD的诊断标准42,43]。FXS的来自X 染色体上的脆性X 精神发育迟滞- 1(FMR1) 基因中的突变编码蛋白质FMRP, 其在RNA 结合中起作用并且在突触处阻断特定mRNA的翻译。这与ASD 特别相关，突触缺陷可能是发病机理的标志和可能的治疗靶点。mRNA翻译的失调不是FXS 所独有的，在结

第6章使用基因通路分析构建ASD的遗传分类 85

节性硬化-1(TSC-1) 和结节性硬化-2(TSC-2) 基因的突变中也导致负责紊乱的 mRNA 翻译失调。结节性硬化症也在患者中具有高的ASD 发病率，估计在 20%～60%之间46]。作为突变的结果，TSC 复合物具有错误功能，其可导致受折磨个体的神经元中的异常蛋白质合成，并且因此负面影响突触的发展和可塑性[44。
另一种具有较高 ASD 发病率的神经发育障碍是Rett 综合征。该疾病几乎只存在于女性中，ASD 症状通常是全部症状的一部分47]。该病症来自甲基 CpG 结合蛋白2(MECP2) 基因的突变，其编码的蛋白质产物结构被认为参与染色质和基因调节，突变存在于所有具有ASD的女性的80%以上44]。转录调节子即MECP2 的破坏，导致Rett 综合征，并且与哺乳动物雷帕霉素靶标 (mTOR)的表达减少和减少的磷酸化S6 激酶(RPS6KB1) 有关，这对于翻译突触蛋白很重要。MECP2 调节脑源性神经营养因子(BDNF)、环AMP 响应元件结合蛋白-1(CREB-1) 和胰岛素生长因子-1(IGF-1), 介导了PI3K/Akt/mTOR/MAPK通路的磷酸化⁴9]。失去对MECP2 蛋白的磷酸化能力而无法响应MECP2S⁴21A;S424Ay小鼠的人工培养海马神经元的活性反应，致使荷包牡丹碱诱导的突触缩小过程受到抑制，而MECP2的缺失导致GRM5信号降低50]。
ASD 中拷贝数的变异(CNV)

在过去十年中，在包括15q11-q13 、16p11.2 、22q11.2 、7q11.23 和 1q21.151-57的各种染色体上的多个不同位点处已经鉴定了ASD 的个体中具有的大的、罕见的和新的CNV51-57]。初步研究指出这些CNV 在 ASD个体中的频率在基因组中比在对照组中增加,后续研究没有证实这些整体变化。因此，全局基因组不稳定性可能不存在于所有ASD 个体中，也不可能局限于某些家庭。虽然大多数CNV是个体的，但在ASD或自闭症特征的个体中也发现了复发性微缺失3]。由于这些CNV 与许多不同的自闭症表型有关，因此很难估计 CNV 对 ASD 整体的个体外显率，然而，这些 CNV在 ASD 中的存在或不存在代表了一种有用的遗传工具，以丰富我们对ASD 遗传学的整体理解。
ASD 中的单核苷酸多态性(SNP)

鉴于ASD的遗传不遵循典型的孟德尔遗传，长期以来一直假设ASD是多基因疾病。遗憾的是，如全基因组关联研究(GWAS) 这样的基于单核苷酸多态性的方法，其所关注的是将基因中的单个 SNP 与 ASD 的发展风险相关联，并没有提供荟萃分析的审查或更大群体的研究的监视目标。这些研究背后的前提是，虽然许多基因可能与 ASD 相关联，但是在基因中可能存在关键的 SNP, 其具有更大的影响，因此能够解释更多遗传差异性。鉴于在研究中确定

86    剖析 ASD 的遗传结构

的候选SNP 缺乏一致性，就是否存在可能附加地产生疾病表型的许多常见遗传变异而言，研究人员开始考虑ASD的风险64],这种方法也被用于其他神经精神障碍，如精神分裂症。然而，尽管ASD的发展风险可能与许多不同基因中的许多常见变体相关，但是很可能这些变体会过度代表一些生物学途径和过程。因此，采用加性途径分析方法可以提供额外的益处。评估SNP 对疾病的贡献或意义的另一个重要方面是：是否存在保护性而不是风险SNP, 其也可以降低或增加疾病风险。

使用基因通路分析的ASD 遗传分类器的开发

在我们最近的出版物中，我们开发并验证了用于ASD的预测性诊断遗传分类器，其在3个独立的队列中(共计3346个ASD患者和3352个对照),ASD 的总体预测准确度在70%～80%。使用从GWAS调查和利用来自自闭症遗传研究交流(AGRE),Simon自闭症研究(SFARI) 和 Wellcome信托出生队列 (WTBC)的 ASD 和对照队列中获得的SNP数据，从而产生了该分类器。分类器的结构由146个基因中的237个SNP 组成，并且包含风险 SNP 以及赋予保护的弹性SNP。我们的方法结合了以下策略从而实现我们的结果。
①病例对照研究设计的使用：尽管通过使用基于家族的设计来研究与神经精神性疾病(如 ASD)相关的基因已经有明确的知识，但是病例-对照研究也是至关重要的，因为父母和未受影响的兄弟姐妹可以表现为自闭症特征，但不足以诊断。这一发现反映了我们以前的分析表明一级亲属是在正常对照组和 ASD的先证者之间65]。病例对照研究的一个缺点是，它们有可能被人口差异所混淆[67,683,例如不同的祖先或地理位置导致的人口差异。虽然一些研究者假设我们的分类器被这种群体效应混淆，我们已经证明并非如此【61,我们将在下面讨论。
②样本人群的富集：考虑到来自不同祖先背景的个体在其遗传结构上会有差异，因此在应用于具有不同祖先的种群时，在同类种群上构建和训练的分类器可能不会精确。这已经通过关于不同病症的许多遗传关联研究显示，表明虽然某些基因可能在限定的群体内具有强关联，但是当研究其他不同祖先的群体时，这些基因不一定具有相同的贡献。基于这些观察，我们将我们的分析仅限于祖先来自中欧(CEU) 的已知祖先标记的个体中使用。
③基因集富集和途径分析：识别感兴趣的强SNP 的常见策略是使用曼哈顿图绘制单个候选SNP 的概率对数值(LOD) 分数，并执行严格的统计截止值以防止I 型错误(假阳性)。虽然这种策略可以用于鉴定特定病症基因中的一些强的候选SNP, 但是它增加了Ⅱ型错误(假阴性)的概率，并且因此忽视了许

第6章使用基因通路分析构建ASD 的遗传分类 87

多潜在的信息分类器SNP。因此，仍需要用于鉴定感兴趣的SNP 的策略。利用原始SNP数据，我们首先鉴定哪些生物学途径被数据超量表示，然后进行置换分析以产生测试统计。在我们的模型中，SNP 的加权被指定为0、1、3,并且根据一个SNP 是否具有两个拷贝的显性等位基因来计算，无论它们是杂合的还是具有两个拷贝的次要等位基因。这些加权的分配提供了比使用0、1、2更大的准确度。此类超加性的建模先前已经用于理解遗传的相互作用701。
④训练和验证：为了训练我们的分类器，我们最初将AGRE 队列分成训练组和验证组，其中分类器在732个ASD个体上训练，然后在剩余的243个个体上验证。我们的分类器在我们的AGRE验证组中达到85.6%的高精度，同时在相关托斯卡纳人群中也达到84.3%,但是更重要的是在包括来自SFARI 家族的737个ASD 案例的独立大数据集中实现了71.7%的准确性，该家族具有单核自闭症和WTBC的2930个控件。
自公布以来，我们用于产生诊断分类器的方法已经受到来自该领域专家的审查，其假定用于得到具有ASD的个体的CEU 群体可以不同，即来自相对于对照个体的不同地理位置。因此，他们认为我们的结果可能受到人口分层的影响,我们通过正确地识别来自中欧(CEU)、芬兰(FIN)、英国(GBR) 和伊比利亚西班牙语(IBS) 群体的控制个体来验证我们的分类器性能。我们发现，当仅使用分类器的一部分时(在FIN 和GBR 组之间观察到高达25%的差异),分类器在这些群体之间分类的得分产生较大差异。然而，使用整个分类器时，种族群体的影响贡献了小于分类器评分总差异的6%。使用我们的分类器，我们检查其在来自FIN 和 GBR( 非 ASD)群体以及SFARI ASD先证者(我们论文中的独立验证样本)的分类控制个体中的预测准确性。我们绘制了分类为ASD的个体相对于分类器中使用的SNP 数量的百分比，其中SNP按其权重的绝对量排序。从图6-1中可以看出，尽管在群体之间的分类器精度差异方面，群体分层可能对较低SNP 数目的分类器准确性具有影响，但是这种效应随着包括更多数目的SNP 而减少。在SFARI/ASD 和FIN/GBR 组之间分类为ASD的百分比分离在50～100个SNP 之间出现梯

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度增加，而在>150个 SNP 时，这些组之间的分离达到最高后又开始稍微减小⁶9 ] 。

SNP以绝对量级排序

图6- 1分类为ASD 的个体的百分比作为以绝对幅度减小排序的SNP 的数量的函数。在较小数量的SNP处观察到显著差异(未绘图)。注意SFARI 病例与FIN 和 GBR之间的SNP在80～150的梯度差异。关键词：ASD,自闭症谱系障碍；SNP,单核苷酸多态性；SFARI-CASES—西蒙斯基金会自闭症研究计划ASD证人；来自1000 个基因组群的群体样品：GBR, 英国；FIN, 芬兰

因此，我们的进一步分析说明，当构建遗传分类器时，遗传改变添加更多信息的阈值不一定会提高如上所述的分类器的性能的阈值。我们进一步表明，人口分层的混杂效应可以控制详细的人口富集。然而，我们认为种族差异迫使单独的和种族上不同的基因分类器进行发展。重要的是，通过不同种族的人口，我们的分析确定了重叠的细胞和分子途径。这表明，尽管编码与这些途径相关的SNP 基因可能在不同族群之间不同，但是与 ASD 相关的潜在病理生理学途径可能是常见的。
SNP 质量控制

在构建基于单核苷酸多态性(SNP)的分类器时，重要的是要确保病例和对照之间的任何等位基因SNP 差异代表的是与表型相关的真实信号，而不是

第6章使用基因通路分析构建ASD 的遗传分类    89

基因分型、实验、群体或其他人工制品。虽然罕见的变异在任何疾病的发病机制中均发挥重要作用，在这里我们只考虑常见遗传变异的相互作用。通常，并非所有数据在一个集合中都可用，这需要合并多个数据集。确保在分析中仅使用在所有平台上进行基因分型的SNP 是至关重要的。可以考虑缺失基因型标记的插补⁷1,但应该极其谨慎地使用。在插补过程中，基于来自其他种族相似的基因型数据集(例如HapMap 数据集)的连锁不平衡统计来估计丢失的 SNP。根据这样的数据，必须注意到许多疾病，特别是神经精神障碍，被假设涉及了许多SNP 的复杂相互作用。
当合并数据集时，重要的是确保相同的链用于跨数据集的每个 SNP 。遗传关联工具，如Plink, 可用于测试数据集之间DNA 链的一致性。如果检测到链不一致，则可以翻转链。其他重要的潜在混淆包括不同平台里基因分型的数据集之间遗漏数据和潜在调用率差异的不同。我们建议丢弃在病例和对照之间差异缺失的基因型标记的数据，其程度大于1%,最小等位基因频率小于 5%的标记和对照中的HardyWeinberg平衡P>0.0001 。Anderson 等7¹描述了类似的协议。测试平台之间的潜在调用率差异也很关键。可以实现这一点的简单方法是在平台之间进行两个基因座测试，并丢弃在预定显著性水平(P= 0.001)的平台之间的统计学有显著差异的任何SNP。

确定种族/祖先和控制人口分层

众所周知，SNP 等位基因频率显示出强烈的种族和地理相关性。在已经进行SNP 质量控制程序之后，下一个重要的步骤是确保群体尽可能种族同源。它的两个主要机制涉及使用祖先信息标记或工具，诸如空间祖先分析 (SPA)⁷3, 在所报告的五百公里的精确度内其能够估计出一个个体的地理祖先。在我们的分析中，我们使用欧洲模型的SPA 来估计我们队列中个人的祖先。在我们的数据集中，与SPA 欧洲模型和组合的自闭症基因研究交流协会(AGRE) 以及Simons 基金会(SFARI)白色非西班牙裔(WNH)数据集共有的SNP 有63840个。我们保留了3452个个体，他们祖先起源的地理坐标是纬度48N～53N, 经度5W～8E。这些地理坐标对应于图6-2所示的北欧地区，其中包括英国、法国、比利时、荷兰和德国的部分地区。
虽然SFARI 队列是三人组、父母以及他们受影响的后代的种族同质的集合，我们还是进行了主成分分析，以确定没有明显的人口分层。主成分分析在 Matlab中使用了所有439264个基因型标记的概率主成分分析(PPCA) 函数。我们将每个个体基因型的值投影到两个主要主成分上。我们还使用 Mann-U测试了沿着每个主成分维度的病例与对照的分布。我们发现没有统

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0                                        15E
图6-2 使用空间祖先分析(SPA)方法，确定描述为“白非西班牙裔”起源(在SFARI 和AGRE数据库中)的4970个个体的地理祖先起源。该图显示了在欧洲地图上绘制的结果，证明这些个体中的大多数具有源自定义区域的祖先，该定义区域由具有坐标 5W~8E(经度)和48N~53N(纬度)的正方形界定

计学上的显著差异。

其他精神障碍遗传分类器的开发

与ASD类似，其他主要精神疾病，如精神分裂症(SZ),双相性精神障碍 (BPD) 和重性抑郁障碍(MDD)的原因和机制尚不清楚，致使诊断有困难。因此，为这些疾病开发可靠的遗传分类器将对诊断和预防具有重要的影响。
孪生研究表明 SZ 、BPD 和 MDD 的遗传率分别为80%。然而，解释这种估计遗传性的实际可遗传单位(例如SNP 基因、CNV 等)的鉴定是难以捉摸的。例如，迄今已发表了超过1000项与精神分裂症相关的GWA 研究，但大部分结果不一致。此外，精神分裂症以及其他常见精神疾病基于SNP 的遗传率估计为<30%。孪生研究和GWAS 之间的遗传不一致性常常被称为“失踪遗传”,在大多数精神障碍中是常见的，并且支持主要精神障碍具有高水平的多基因和异质性的概念。因此，使用单变量关联测试程序和严格统计阈值(例如P<1.0×10-⁵) 的传统GWAS 是次要的，并且不能捕

第6章使用基因通路分析构建ASD 的遗传分类 91

获可能构成这些疾病的复杂相互作用。一种有希望的替代方法就是利用基因网络或途径，例如在我们的ASD分类器的开发中使用的方法，这样做更适合捕获生物学复杂性。因此，这种方法可以适应和用于开发一系列精神疾病的分类器，其具有与ASD 相当的遗传性和表型异质性水平。

未来方向

未来的ASD 遗传研究将通过人类基因组技术的进步，如下一代测序(如第4章所述),来进行更详细的映射。对基因组的这种更详细和更仔细的检查可以发现新的候选基因座、基因、SNP 或 CNV, 并且更重要的是，将提供进一步表征已经涉及的遗传热点的能力。在未来的遗传诊断分类器的开发中这些数据将有巨大的潜力来提供累加效应。这种增加的知识将提供关于种族之间遗传结构差异的进一步细节，从而为研究人员提供更大的诸如人口分层等影响的控制能力。它还将有助于确定种族间和种族内能存在的疾病共同或独特的遗传特征。尽管遗传研究在鉴定疾病的候选标记物中具有很大的实用性，但重要的是将这些研究与利用ASD患者的血液和死后脑样品调查的更多功能基因和蛋白质表达进行配对。在这样做，我们可以开始更好地理解ASD中涉及的病因学过程，以及如何更好地针对他们来治疗，不是仅仅停留在统计学遗传学层面而不考虑生物学意义。

本章要点

● 自闭症谱系障碍(ASD) 中的许多遗传研究已经鉴定与该神经发育障碍相关的单核苷酸多态性(SNP)和拷贝数变体(CNV) 。然而，随着研究的进展，证据表明这些遗传改变可能局限于特定家族或群体，其在较大群体中的外显率稍低。
●采取更广泛的观点，一些研究人员假定ASD 的遗传学可能由常见遗传变异的加性集合组成，当彼此组合考虑时，能够解释更多疾病的遗传性。除了对 ASD遗传学进行更全面的观察之外，还必须考虑这些改变对 ASD的临床状况的影响。
●为了鉴定有助于ASD 遗传的常见变体，逻辑方法是利用基因途径分析以评估哪些途径和变体可用于构建ASD的遗传分类器。当采用这种策略时，对于调查来说重要的是不仅要关注可能赋予风险的变体，也要关注可能是保护性的变体，同时还要控制其他潜在的混淆，如人口分层。尽管已经证明该方法可用于将ASD个体从对照中分类，但是也存在采用类似方法用于其

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他复杂的精神疾病如精神分裂症的范围，其中也存在大的遗传数据库。

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自闭症的异常基因调控：从转录到翻译

第 7 章

自闭症血液和淋巴母细胞泛基因组表达的研究

BoryanaStamova,FrankR.Sharp 潘娜译，丁岩孔学君校

摘要
源于自闭症(ASD) 患者血液和淋巴母细胞系的mRNA 和 miRNA 表达研究显示了研究之间共享的几个基因。一些基因包括：BTG1、HOOK3、FCGBP、 REV3L、CCDC47 和MAP4 在至少三个研究中被重复，所有这些基因都涉及细胞增殖。已在至少两个研究中重复的途径包括：mTOR、神经营养因子信号传导、肌动蛋白细胞骨架/ILK信号传导、VEGF和自然杀伤细胞信号。 mTOR 信号的异常涉及原因未明的ASD以及与ASD相关的遗传综合征，包括脆性X 、 TSC1、TSC2、NF-1 和 PTEN。本章综述了对血液和淋巴母细胞的细胞系和脑组织基因表达研究，尽管缺乏共享的基因，但揭示了原因未明的ASD和遗传性亚型亚组的共同途径，并表明以通路为导向的方法可以更好地鉴别治疗目标。
关键词：自闭症；基因表达；RNA表达；microRNA;微阵列；血液；白细胞；淋巴母细胞样细胞系；替代拼接；路径。

前言

虽然现在自闭症谱系障碍(ASD) 的遗传原因可以归因于接近25%的受试者，其余ASD 病患的“病因”仍不清楚。ASD是高度可遗传的，虽然这种遗传性的性质仍然是有争议的。一个可能性是数百种遗传原因仍有待确定，可能涉及基因组的非编码部分。另一个可能性是ASD是一种复杂的遗传疾病，其中一组的10～50个基因与环境因子相互作用导致ASD。
无论哪一个模式，数百个个体罕见突变还是复杂遗传疾病——它们都导

101

102 自闭症的异常基因调控：从转录到翻译

致类似的与社会交往受损、语言功能障碍和刻板行为相关的临床综合征。一般认为这些缺陷与调解这些行为的特定脑区域异常有关，并且与特定的分子集合和在那些脑区域的分子通路相有关。确定常见的分子和分子途径将是非常有用的：①开发诊断生物标志物；②开发预后生物标志物；③潜在地识别与 ASD 相关的环境因素；④鉴定可能是几个 ASD 病因共同的治疗靶点；⑤鉴定响应治疗的标志物。
在这个领域的一个很大的问题是缺乏研究这些通路用的人脑材料。对大脑的研究已经被各种各样的理由所限制，我们需要找到这个问题的解决方法。少数研究人员已经开始确定，是否外周血液和/或外周血来源的淋巴母细胞系 (LCL) 可能提供ASD表型的信息，可能还有 ASD 大脑的异常，以及ASD 潜在的遗传异常，健康和/或环境等因素。
虽然有些人怀疑研究血液和LCL对于ASD的价值，这里有多个原因关于为什么要研究外周组织，它们可能有助于理解ASD 的发病机制。包括：①在血液中表达的许多基因也在大脑中表达；②在ASD受试者亚群中观察到外周免疫异常提示血淋巴细胞中基因表达的改变6;③血液中的单核细胞和脑中的小胶质细胞具有非常相似的转录，在ASD的脑组织中观察到小胶质细胞的异常7,8];④一组已知在外周血中表达的免疫分子的RNA,在 ASD 患者的大脑中也显示发生改变9];⑤ASD 遗传和环境因素可能都影响外周血中基因的表达并且可能随时间而改变；⑥环境中有害的物质增加ASD 的风险并可能对外周血中的基因表达产生特有的变化；⑦相似发病机制的亚群可能在血液和脑中有类似的基因表达特征；⑧从诊断角度讲，血液标本较脑组织更容易获得。
LCL已经被许多研究组用于ASD基因表达研究。这些细胞系具有不需要抽血的优点，它们能够反映出许多ASD组群和对照之间的遗传差异，并且可以比较容易地对给定的实验进行培养。此外，它们允许实验操作，例如毒物的反应，以及允许验证不同实验室之间的结果。LCL的另一个优势是它们不仅可以从诊断验证的ASD 细胞库中获得，而且还获得了患者的综合表型数据。
本评论将总结来自ASD 儿童全血和LCL的全基因组 RNA 表达的研究。随后将讨论目前ASD信息通路的研究进展。

ASDLCLmRNA表达的研究

LCL是通过将EBV(EpsteinBarr病毒)与血液样品一起温育导致B 细胞的永生化而产生。LCL 可以培养，低温保存并进行长时间的研究。它们为取样和潜在的各种实验处理和操作提供方便。

表7-1 ASD受试者中淋巴母细胞细胞系的全基因组研究

研究样品                使用的数组       注释

5对ASD双胞胎与ASD严重程度不一致 TIGR 40K 人类 43组基因，包括ROBO1,CYP1B1,线粒体乌头酸酶，ECAT11,IL6ST,精氨基琥珀酸合成酶，NAGLU,P2X5a,CD38
6名ASD,6名对照 Invitrogen cDNA阵列 9组下调基因包括SEMA5A
3名ASD,3名兄弟姐妹 Affymetrix U95 48组基因，包括CD44,ITGB7,FLOT2和TPM4
15名ASD,27名对照 Agilent 68和FMR1-FM和dup(15q)共有的基因。JAKMIP1,GGPR155
20对sib:ASD和对照 TIGR 40K
人类阵列，PCR 神经元发育和类固醇生物合成途径
116名受试者：ASD和对照 TIGR 40K
人类阵列，PC ITGAM,NFKB1,MBD2,RHOA,SLIT2在ASD中通过PCR减少昼夜节律基因

40名ASD,40名未受影响的父母

PCR
CD38减少

20名ASD,22名对照兄弟姐妹
IIlumina微阵列
HEY1,SOX9,IFITM3,TPM2,ARHGAP24,LM02,HLA-DRB1,IL32,UCHL1, MFGE8,LEF1,TGFBR2
82名ASD,64名对照 Affy U133 微阵列选择性剪接，锌，泛素，转录通路
35名ASD,35名对照 PCR NLGN3,SHANK3
244名有不和谐儿童的家庭 Illumina阵列结构变体(CNV)对ASD中的RNA表达有影响

16名ASD和16名对照(男性 ) Affy U133 微阵列
202组基因，89组通过PCR证实的上调FOXP1
Affymetrix 单核苷酸多态性(SNP)近邻SEMA5A与表达相同的基因与自闭症调节网
公共数据库人类Exon 1.0 络相关
ST阵列

104    自闭症的异常基因调控：从转录到翻译

目前已经使用LCL方法进行了大量的关于ASD 的研究，并且总结在表7-1中。值得注意的是，已经使用了许多不同的实验方案，包括将ASD个体与无关联对照组或兄弟姐妹对照组进行比较，以及比较异卵双胞胎。通常样品的量较小并使用许多不同的表达平台。除了不同样品群体研究的临床或表型异质性之外，这些因素可能解释为什么只有非常少的基因得到不同实验研究组同时验证/证实。尽管单个基因确认无法实现，几乎所有的研究都证实包括包括神经发育、选择性剪接/转录调节和免疫基因等类似的信息通路。例如， CD38在两个单独的研究中得到证实。 CD38 是在 B 细胞、自然杀伤 (NK) 细胞和其他免疫细胞的表面发现的多功能酶，其能催化合成和水解环状ADP-核糖(cADPR) 使 NAD 转化为ADP-核糖。CD38的减少可能与人的免疫功能损伤相关，还可能与 ASD受损的免疫功能有关6。在表7- 1中列举的 ASD 及对照LCL许多差异表达基因直接参与或表明与ASD 或其他神经发育有关，这些基因包括SEMA5A,NLGN3,SHANK3 和 FOXP1。对于那些无法重复的个别基因我们将在本章结尾讨论。
令人感兴趣的是，我们发现了大量的来自ASD 个体LCL 的差异表达基因同时也在ASD个体的大脑中显著性地差异表达。Voineagu 对这些基因进行了总结,包括： ARMC8,ATP2B2,DGCR9,IFITM3,MAP4,NFKBIZ,
PDE4DIP,PFTK1,PRKCE,RBMS1,SOX9,TNPO1,TOX,TSPO,UCHL1 和 YAP1 (也总结在表7-4中)。在这些基因中，有几种与ASD相关。IFITM3在防御流感中起作用；NFKBIZ与调节对细菌反应的Kappa B 家族蛋白质有关；PRKCE 调节行为和免疫反应；SOX9调节男性分化；易位蛋白(TSPO) 发现于外线粒体膜上，其中它与StAR(类固醇类急性调节蛋白)相互作用，并将胆固醇转运到线粒体中；在所有的神经元中都有的UCHL1,能在蛋白质降解过程中通过水解泛素的小C-末端加合物来产生泛素单体。感染、免疫反应、线粒体异常、男性性别和蛋白质翻译和降解的异常都与ASD有关。

ASD LCLmicroRNA(miRNA)的表达研究

类似地，已经有几项研究验证了ASD 个体与各种类型对照组对比miRNA的表达存在显著差异。这些结果总结在表7-2中。虽然已知的报道发现很少共同的miRNA,有三个研究发现了miR-23a 的失调。miR-23a 在免疫功能中起作用，其在多发性硬化患者的血液中降低,并且还能调节 DNA 损伤修复。miR-23a 调节X 连锁的细胞凋亡抑制

第7章自闭症血液和淋巴母细胞泛基因组表达的研究 105
剂(XIAP) 涉及对脑缺血反应的性别差异22]。最后，miR-23a 在 ASD个体小脑中与对照组相比存在差异性的表达[16。
表7-2在A       SD个体LCL和脑组织中的miRNA的全基因组研究

研究样本组织来源使用的数组注释

ASD和对照

8名ASD双胞胎，6名未受影响的对照
对照组

6名ASD,6名对照

13名ASD,13名对
照淋巴母细胞细胞系
淋巴母细胞细胞系

淋巴母细胞细胞系

小脑皮质 Illumina Universal-12 BeadChip
Custom Plated Microar- rays

pParaflo miRNA mi-

croarray

Multiplex PCR
miR-486,miR-181b

miR-23a,miR-106b, miR-29b

9miRNA(23a,b;132;
146a,b;663;92,320)

28miRNA一和miR-23a

miR-106b是另一种在ASD个体的LCL和小脑中失调的microRNA。 MiR-106b通过抑制ABCA1 表达而损害胆固醇流出并增加 Aβ 水平23]。mi- croRNA簇 miR-106b～25也可以调节成人神经干/祖细胞增殖和神经元分化。因此，这些LCL研究结果已确定一些差异表达的mRNA和 miRNA或者在ASD大脑中体现或者与ASD的发病机理相关。

RNA 表达研究与基因型的关系

只有最近研究人员开始考虑基因型的研究。例如，Luo 等人使用LCL 检查罕见的新生和复发性CNV 对 ASD 基因表达的影响。此外，确定具体的基因表达模式特异性微缺失和微重复，以及其中的一些与ASD 的临床表型相关。同样，自闭症基因的转录表达减低会受遗传的和新生CNV 影响。eQTL 映射方法显示罕见SEMA5A 调节网络中的变体影响自闭症风险，27eQTL 是基因中的特定SNP 相关的基因与基因的表达。

ASD 血液的RNA 表达研究

研究血液比LCL 或其他培养细胞的优势在于在采血时能捕获“生理状

106 自闭症的异常基因调控：从转录到翻译

态”和/或ASD受试者采血时经历的“环境影响”。此外，使用血液收集管在收血液时能立即稳定RNA 也有助于确保适当捕获这种生理或环境效应。因此，越来越多的研究现在已经使用原代血细胞。这些研究总结在表7-3中。
到目前为止的血液研究显示，不同的研究中较少发现有共同的基因(在下面的段落中讨论)。缺乏共同基因的原因与LCL的研究报道是类似的：使用不同的芯片平台；不同的采血方法，例如 EDTA,PAXgene管；外周血单核细胞或全血；不同年龄段的受试者；不同的人口统计学和临床表型(表7-3)。此外，大多数样本量都很小。
尽管来自上述血液研究取得一定进展，当比较LCL、血液和脑的表达研究时，它们之间存在共享的基因和信号通路。为了证明这一点，我们最近比较了2～4岁ASD患病男孩(n=30) 和年龄匹配发育正常的对照组男孩(n= 20)的研究。将血液收集到 PAX 基因管中并立即稳定 RNA, 并且在 Affymetrix 外显子表达芯片上评估RNA表达和可变剪接283。经过预测并且校正多重样本比较后，ASD 与对照比较，预测总共53个基因出现差异选择性剪接。然而，当我们使用更大的基因列表(n=477) 来评估信息通路(图7- 1)并与其他基因表达研究相比较(表7-4 )。这477个基因在基因中表现出显著的选择性剪接(P<0.05) 和至少一个外显子的显著表达差异(P<0.005 和差异性表达倍数变化>1.2)。由于使用的外显子芯片不包含覆盖外显子- 外显子连接的探针组，推导出来的差异选择性剪接(DAS) 是间接的，因为测量的单位是外显子表达来提供外显子使用的量度。因此，我们使用术语“差异选择性剪接/差异外显子使用(DAS/DEU)”来强调在这些研究中用差异外显子表达来预测DAS。
我们通过这477个基因与文献中报道的血液、LCL 和脑组织中经选择性基因表达确认的基因比较(表7-4),并且从重叠比较得到几个结论。 Stamova 的研究和任何其他研究之间只有相对较少的共享基因。当人们意识到，尽管 Kong和 Gregg研究使用几乎相同的技术方法，但是却没有共享的基因,却发现了一些共享基因。而以脑组织为材料时，Stamova等人与Voineagu 等人9的研究甚至发现了更多共享基因。粗体字标注的基因(表7-4)是在至少三个研究(n=6 个基因)之间共享的基因。这些缺乏共享的差异表达基因的结果表明 ASD原因/病理生理学具有巨大的异质性。
说到这一点，还有一些常见的基因值得提及。Stamova 和 Talebizadeh Affy- metrix外显子芯片研究显示，与对照相比，ASD 个体中的HOOK3 和 REV3L 基因(表7-4)都预测为可变剪接。这些结果需要使用直接方法对独立样品

SD患者血样本的全基

研究       样本使用的数组注释

36名ASD 12名对照
Affymetrix
U133,PCR PAM,SPON2,II2RB,PRF1,GZM,CS3CR1,EAT2,EDG8, IGFBP7,ZNF145,KIR3DL2
      52名ASD,27名对照-PAX基因管 Affymetrix U133    自然杀伤细胞基因/NK细胞的功能性功能障碍

21名ASD成人和对照；21名ASD儿童和对照母亲的母亲-PAX基因管 Agilent 19个不同于ASD的基因与对照；与对照母亲相比，ASD 母亲具有一些表达差异
8名ASD/SPAD,39 ASD,37名对照，
12 SPAD Agilent 外周血单核细胞——TGFBR,Notch,EGFR1
      60名ASD,68名对照；EDTA管
Illumina 48探针分类器，其面积曲线下0.91。免疫应答基因，血红蛋白复合物和鸟嘌呤或鸟苷酸结合
20名ASD,20名同胞，18名对照-PAX 基因管 Affymetrix U133 先证者与兄弟姐妹的核糖体，剪接体和线粒体途径的上调和神经受体-配体，免疫和钙信号的下调
66名男性ASD和33名对照；在PAX- Affymetrix U133,Af- 55基因特征预测ASD与对照组，曲线下面积为0.7。途
         gene试管中104名ASD和82名对照 fyGeneST 径：中性蛋白；FCy和ε;趋化因子mTOR;B,T和自然杀手信号；Erb B,VEGF,Notch
letovsky等人 2013年的综述 ASD和对照；培训和测试队列-PAXg 基因管 RNAseq 面积曲线下预测ASD约0.60
      30名ASD,20名对照，2～4岁；PAX Affymetrix Exon Ex- 53个基因鉴别ASD;途径： ROS,Nrf2,LK,NK细胞，
基因管 pression arrays FCγ,HMGB1,TREM1,Jak/Stat,VEGF,PI3K/AKT/
mTOR,NFkB,PAK,NGF,GF-CSF,Ceramlde,肌动蛋白，CTLA4

108             自闭症的异常基因调控：从转录到翻译

DASmTOR信号通路中基因的PCA分析

■ 类TDASD-TD中心2倍SD
■非类TDASD-TD中心2倍SD 以外
BTG蛋白家族细胞分裂循环调节磷酸戊糖途径
由ARP-WASP复合体诱导的肌动蛋白成核细胞毒性T淋巴细胞CTLA信号通路
神经酰胺信号通路 GM-CSF信号通路PAK信号通路
NGF信号通路
NF-KB信号通路
mTOR信号通路
PI3K/AKT信号通路
巨噬细胞NO和ROS产生 VEGF信号通路
肌动蛋白细胞骨架信号通路 JAK/Stat信号通路
TREM1信号通路
树突细胞成熟
HMGB1信号通路
巨噬细胞和单核细胞Fc-gama吞噬自然杀伤细胞信号通路
ILK信号通路
ASD细胞

图7-1 ASD中的信号通路与典型的发育控制(TD) 。该图发表于2013年的《分子自闭症》杂志(MolecularAutism)(Stamova等人，2013)。个体水平分析。ASD受试者的分级聚类和显著通路(P<0.05) 。每个 ASD受试者在每个重要通路被评分为类TD, 如果其PCA 位置在基因的3-D PCA 图上与特定途径中的DAS/DEU 在2倍标准偏差(SD) 的 TD 质心(在TD 椭圆体内);或作为非类TD, 如果其PCA 位置在3-D PCA组合空间上超出TD 质心的2倍 SD(TD椭圆体外部)。评分方案的一个实例(在右上角)显示的是mTOR 信号通路中的显著性基因。转载自 Stamova 等

表7-4在 ASD中失调的基因，其在至少两个研究之间共享或在三个
研究之间共享(粗体)

研究    组织和平台基因与Stamova等人共享研究全血- PAXgene管-外显子阵列
淋巴母细胞细胞系-TIGR 阵列
BTGI,DSE,HOOK3,KRCCI,LRPIl.MCRSI,MCTP2, ANKRD17,CD83,DHX15,DSE,EHD4,FAF1,FCG- BP,FNBP1,LRRC41,NF1,PPP2R2A,REV3L , RNF32,SFPQ,SND1,STAT5B,TSSK4,COX4NB,AKT3,CCDC47,CTSO,GFER,MAP4

第7章自闭症血液和淋巴母细胞泛基因组表达的研究    109续表
研究组织和平台基因与Stamova等人共享研究全血- PAXgene管-外显子阵列
全血-PAXgene管U133阵列
DNMBP.PALLD,STX5

全血-PAXgene管U133阵列 ARL4C,CCDC47,CEBPG,EEAl,EIF4A2,FXRI,
ROCK2,USP9Y,CAB39,CMYA5,DNMBP,LSM14B, MAML3,PCF11,SPOPL,TMCO3,TOR1AIP1,
TTC14,WAPAL,YTHDC1,ZBED4
淋巴母细胞系-外显子阵列 EZR,HOOK3,MACF1.MRPS27,REV3L,RPN1,TARS

脑组织-IIlumina数组 ALDH18A1,ANKRA2,BRPF1,BTG1,Clorfl31,CCDC90B, CHD5,COL7A1,EPHX1,FAIM2, FCGBP,GPNMB,INA^NTUITGBIBPI,LRP1B,LYN,MAP3K12,MAP4, MIB2,PALLD,PFKP,PTK2B,SLC4A8,STAT4,
UCHL1,ULK1,ZBTB40,BAI2,BIN1,CHPT1,
DYNC112,FEZ2,GPATCH4,INTS10,LSM14A,
LSM14B,MADD,MFSD6,PLEKHA5,SCRIB,SYNE1

进行确认。Hook蛋白具有附着于微管的N-末端结构域和介导与细胞器结合得更加不同的C-末端结构域33】。Hook3与 PCM1相互作用以调节周期性物质装配和神经生成的时间34,并与清道夫受体A 相互作用来调节先天免疫35]。 Rev3L亚基与Rev7 相互作用形成Polζ, 一种B 家族聚合酶。Polζ 缺乏3′→5' 核酸外切酶活性并且是中度保真聚合酶。它不能从DNA损伤添加核苷酸，但它可以从具有末端错配的引物延伸。DNA 聚合酶ζ是正常哺乳动物细胞36] 的增殖所必需的，并且聚合酶的破坏可致胚胎发育死亡³7]。因此推测，在ASD中，Hook3和 Rev3L 两个基因通过差异性剪接来调节细胞增殖，并且可能与 ASD个体大脑一些区域的神经元数量改变相关。
BTG1、FCGBP和MAP4分别在三个不同的ASD的研究中显示差异性调控，其中包括一项脑组织的研究。据推测在ASD患者的血液中上述三个基因发生可变剪接9,28,31]。BTG1下调细胞增殖和神经生成。BTG1(B细胞易位基因1)需要维持脑和牙齿回的干细胞和祖细胞池和室下区3³9]。BTG1基因的多态性与多发性硬化相关，提示在免疫调节中起作用40]。BTG1 也使大脑小胶质细胞对细胞凋亡敏感。因此，BTG1可能从多个层面参与ASD的病理机制- 神经发生，免疫功能，甚至性别决定。FCGBP(FCγ 片段IgG 结合蛋白)是一个

110    自闭症的异常基因调控：从转录到翻译

IgG-Fc 的受体，可能与祖细胞有关43。
已有报道，患有自身免疫性疾病患者的血液中FCGBP抗原血浆水平升高。MAP4 与隔蛋白结合并通过控制隔蛋白对微管的可及性而稳定微管。MAP4也能与肌动蛋白丝结合并调节它的属性。MAP4在微管上的过表达可以破坏信使核糖核蛋白颗粒(mRNP)到翻译部位。MAP4通过微管增强及DYNLT1与 VDAC1的相互作用在缺氧情况下帮助稳定线粒体通透性。MAP4的磷酸化影响微管性质和细胞周期进展51]。MAP4和CLASP1通过安全机制来保持有丝分裂中主轴位置稳定52。MAP4 在大脑Purkinje 细胞和海马锥体神经元高度富集。MAP4 在阿尔茨海默氏病脑中失调。MAP4 抑制神经母细胞瘤中的G 蛋白受体运输细胞【56]。此外， MAP4 受 CTNNB1 (钙粘蛋白相关蛋白，Catenin β1)的调控。使用从 Simons Simplex库中的ASD受试者，CTNNB1的新生变异已在两个独立的报告中被确认57,58]。此外，微管相关蛋白家族的另一成员，MAP2 也显示与ASD 发病有关[59,60。

与 ASD 相关的信息通路

尽管在整个基因组表达研究之间单个基因的确认度相对较低(表7-4), 但在不同的研究之间信息通路的重复性比较高。我们是第一个提示 ASD 与 NK 细胞基因的过表达相关30,61]。这一发现部分通过最近对在U133 芯片上处理的全血RNA进行的研究[29以及在我们最近的外显子表达和在Affymetrix 外显子芯片上处理的全血 RNA 可变剪接的预测究中得到证实[28。
事实上，如果比较Kong和 Stamova的研究28,29】,在ASD个体与对照组的血液中有几种类似的信息通路失调。Kong报告了以下信息通路：神经营养因子，FcyR 介导的吞噬作用，肾细胞癌，趋化因子，肌动蛋白的调节细胞骨架， mTOR,铬髓样白血病，Fc 附加体RI,B细胞，T 细胞，区域黏附，ErbB,NK 细胞，VEGF,孕酮，长期增强/抑制，notch, 溶酶体，白细胞跨内皮迁移，内吞作用和 MAPK信号29。 Stamova报道了以下信息通路：ILK(肌动蛋白细胞骨架), 自然杀伤，Fcy,HMGB1, 树突状细胞，TREM1,JAK/Stat, 肌动蛋白细胞骨架， VEGF,巨噬细胞 NO 和 ROS,PI3K/AKT/mTOR,NFkappaB,NGF,PAK,GM-    CSF,神经酰胺。

检查ASD 个体中的失调信息通路

我们最近开发了一种在给定的ASD 个体中确定哪些通路发生了失调的方

第7章自闭症血液和淋巴母细胞泛基因组表达的研究 111

法。如上所述，使用外显子表达芯片，我们鉴定了477个基因，并预测这些基因具有不同的可变性剪接(DAS) 并且在ASD 和典型发育(TD) 个体之间的外显子表达(差异外显子使用，DEU) 具有显著差异(P<0.005) 。这477个基因的信息通路分析显示 ASD 与 TD 比较(P<0.05) 有21个显著不同的通路。
然后我们确定每个ASD 患者中21个信息通路中哪一个通路失调。为此，我们对预测在每个过表达通路中具有DAS/DEU 的外显子表达水平进行主成分分析(PCA) 作图。例如，mTOR 信号通路(图7-1,右上方插图)的PCA图是基于预测具有 DAS/DEU 的 mTOR 基因中的8个外显子的表达水平做出的。基于PCA 图内每个ASD 受试者的位置，将siRNA 信号通路记为TD 样(如果在TD 质心的2倍标准偏差内)或非TD 样(如果在TD 质心的2倍标准偏差之外)(图7-1,右上方插图)。然后对21个显著过表达经典通路中的每一个通路进行相同的分析(图7-1)。ASD 受试者和21个经典通路的层次聚类法分析(图7-1)不同的受试者显示不同的通路组合(非TD 样 ASD,灰色矩形)(图7-1)。没有任何一个通路在所有受试者中受影响。5个ASD 受试者显示所有21个通路的影响(图7-1,右侧X 轴簇),但有一些ASD受试者只有几个受影响的通路(图7-1,X 轴簇的左侧)。在大多数 ASD 受试者中影响的途径包括ILK 信号传导，NK 细胞信号传导和Fcy 受体介导的巨噬细胞和单核细胞中的吞噬作用(图7-1,簇的下部)。在30个ASD 受试者中有18个mTOR 通路发生改变(图7-1)。
这些数据的重要性体现在以下几个原因。它们提示没有任何一个通路在所有受试者中共享。此外，即使在许多共同的通路中，每个ASD 个体似乎具有不同的受影响的通路。因此，ASD 似乎与不同的通路的组合相关而且存在个体差异。

ASD 通路研究的重要性

图7-2显示了图7-1中确认的一些途径之间的关系。在一些 ASD受试者中观察到几个通路的汇集有力说明这些途径意义，提示与ASD 相关的生物学机理的一致性。尽管图7-1中的数据对于诊断或预后的生物标志物的开发而言是不乐观的，即使该异常调节有不同原因，它们确实提示ASD 受试者的亚群可能具有SAME途径的调节异常。
以 mTOR 信号传导通路为例，图7-1的数据表明30个ASD受试者中有18 个具有mTOR 通路的调节异常。值得注意的是，Kong 等人的研究还发现 mTOR 信号通路与ASD 相关(P=0.014) 。mTOR 特别有趣，因为至少一些

112    自闭症的异常基因调控：从转录到翻译

EMC          NGF 和其他生长因素
整合素β       RTK
PTEN

ILK                                  PI3K

CD42             β-parvin          AKT/PKB                   GSK3-                → β-catenin

肌动蛋白细胞骨架
mTOR NFkB CREB WNT 信号
p70 S6K

神经突的增生和分化
蛋白质的合成
炎症免疫反应存活细胞的增殖
神经元中存活神经突触的生长和分化
细胞增殖

图7-2确认的一些通路之间的关系。 ILK(整联蛋白连接激酶)耦合整联蛋白受体的作用来调节肌动蛋白骨架，以及AKT的作用来影响mTOR 和 NFkB 通路

ASD受试者的信号传导中人类和动物研究都支持mTOR的作用。
异常mTOR信号传导涉及单基因疾病，可能与一些 ASD 受试者相关。典型的实例是结节性硬化症(TSC),其中一些患有TSC 的儿童也具有ASD,两种遗传形式的TSC 与 mTOR 通路的上调有相关的关系。用雷帕霉素抑制TSC小鼠中mTOR 途径逆转受损的相互作用63],和用于治疗与TSC 相关的肿瘤的雷帕霉素也已被建议作为TSC 患者中ASD 样特征的治疗。
另一个例子是脆性X 综合征，其在约1/3的病例中与ASD 相关。已经在具有脆性X 的人以及脆性X 的动物模型中证明增加的mTOR 信号传导。基因去除p70S6激酶1,可以校正mTOR 信号传导的异常，校正脆性X 综合征老鼠的分子、突触和行为表型。在一些受试者中与ASD相关的神经纤维瘤病(NF-1) 也显示上调mTOR 信号传导。因此，雷帕霉素用于NF 临床试验。引起mTOR⁷2-74]失调的PTEN 基因突变也与ASD 和充分报道的某些 ASD病例的解剖特征的大头畸变有关。
因此，多种与TSC1、TSC2、脆性X、NF-1 和 PTEN等基因引起的 mTOR 信号传导调节异常相关的综合征病症也与ASD相关74]。这些临床发现促使各种研究表明干扰蛋白质合成或蛋白质合成调节剂，如延长因子，可能与人类和动物ASD模型的临床特征相关1,62,64,65,68,75-79]。

第7章自闭症血液和淋巴母细胞泛基因组表达的研究    113
这些ASD 单基因病因研究以及原因未明ASD²,28]提示，原因未明ASD病例的亚组可能与mTOR信号通路的异常有关(图7-1和图7-2)。如果是这样，在未来的临床试验中，对这些ASD受试者可以使用mTOR 抑制剂如雷帕霉素来对行为表型的潜在影响进行研究。对ASD病例现有研究中发现的其他信号通路，如果可以证实存在，提示 NGF/ 神经营养因子信号传导、NK 细胞信号传导、巨噬细胞和单核细胞中的Fcy 吞噬作用，以及在至少几个独立研究中观察到的RORA 信号传导等都可能成为新的靶向治疗作用点。

未来方向

由于在ASD研究中发现常见的信号通路发生失调，尽管只有几个有共同的基因，着眼于对已知 ASD信号通路研究还是很有希望的。设计针对10-30 个潜在信号通路的表达研究可能更有成效。但是，设计这些研究需要特别小心，研究时应该包括通路中大多数基因，因为个别基因的重复性很低。确认 ASD信号通路调节能够便于使用动物模型来观察这些通路的干扰是否导致与 ASD 相关的行为异常——类似于已经对 AKT/PI3K/mTOR 翻译的研究。此外，仔细注意ASD的临床特征也可能使信号通路研究更富有成果，因为它们可能有助于富集某些途径的受试者。以大头畸变型为例子，其中可变性剪接的差异在具有正常脑容量的 ASD 儿童中比具有大的脑容量的 ASD 儿童更明显[28。
最近ASD 可变性剪接失调的研究与对照组大脑9、血液和淋巴母细胞细胞系32提示这些研究中有许多共有的基因。可变性剪接可能在血液和脑中是不同的，但也可能与选择性剪接的失调相关核心基因或通路与ASD 特别相关。ASD 中差异性选择剪接的直接确认将是有用的，特别是如果比较脑和血液。这提示一些血液和大脑共同的可变性剪接机制的异常或者是特别的信息通路的异常。其他如表观遗传机制的研究可能同样富有成效[82,83。

本章要点

●在已发表的ASD 研究中，很少发现共同的基因失调。
●在已发表的ASD 研究中存在一些共同的功能失调通路。
● ASD受试者亚群可能具有类似的信息通路的失调。
● mTOR通路似乎在一些 ASD 受试者中失调。
●可变性剪接与ASD 的病理生理学有关。

114                自闭症的异常基因调控：从转录到翻译

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第 8 章

在“黑暗”中搜索：非编码 RNA作为新的自闭症研究领域

Tewarit Sarachana,Valerie W.Hu 潘娜译，丁岩孔学君校

摘要
自闭症谱系障碍(ASD) 是一组神经发育-精神障碍，以社会沟通缺欠、存在冷漠和(或)重复性行为为特征。因为其遗传度高，遗传研究主要集中在基因组的蛋白质编码区，来确认可引起或增加这种疾病易感基因突变、罕见和常见的单核苷酸多态性和拷贝数变异。然而，没有单个基因，SNP 或 DNA 突变可以占ASD病例的1%～2%以上。最近的研究已经开始探索基因组“暗物质”(不直接编码蛋白的DNA区域),其含有许多类型的基因调节元素，包括非编码RNA(ncRNA) 。然而，ASD的ncRNA研究仍然处于其婴儿期，虽然重要，然而只有少数ASD ncRNA 研究。本文总结了研究的证据，建议未来的自闭症研究需要扩大到覆盖剩余的98%的基因组，特别是ncRNA,并强调需要把受试者分成亚群以减少研究组内的异质性，以便比较不同独立队列之间的差异。
关键词：非编码RNA;miRNA;snoRNA;生物标志物。

前言

自闭症谱系障碍(ASD) 是一组神经发育障碍，其特征包括相互社交障碍、语言和非语言沟通的缺陷以及冷漠和重复或定型的行为。根据2013年出版的 DSM-5诊断手册，ASD 包括自闭症(有时称为自闭症或经典ASD) 、Rett 综合征、儿童崩解性障碍(CDD)、普遍性发育障碍——未定义(PDD-NOS) 和 As- perger综合征1。在许多情况下，患者2~3岁时可以观察到与ASD相关的行为异常，但受影响个体的严重程度可能差别很大。最严重的自闭症个体，通常

121

122    自闭症的异常基因调控：从转录到翻译

是完全的非语言，表现出严重的刻板印象、社会障碍和智力缺陷。相比之下， Asperger的症状通常直到学龄前或以后才能通过常规试验评估发现他们的早期语言发育延迟和智力缺陷。但是，他们还是在社会交往互动中表现出一些困难，例如在谈话时很少用眼睛接触对方或对理解幽默或戏弄有障碍。ASD 的流行病学调查显示，在美国，ASD的患病率显著增加，从1970年1:140002] 到最近几年的大约1:88³。据报道，ASD男性的患病率比女性较高，各种比例取决于人类群体研究4-6J。虽然ASD的这一较高的比率可能是一个间接因素包括改善诊断和意识等造成的，最近的研究表明，诊断，包括较轻的病例和较早的诊断年龄不能完全解释这样的迅猛增加，提示实际ASD的发病率确实增加。
尽管对导致ASD 的病因还了解很少，遗传和环境因素被认为起着重要的作用。基于一致性来自孪生和家庭研究的数据，发现ASD 是所有最可遗传的精神疾病其中之一，其遗传性可高达90%。已知遗传基础的 ASD 包括脆性X综合征和Rett 综合征。脆性X 综合征是由X 染色体FMR1基因突变引起的导致三联体重复(CGG) 在基因启动子内的扩展。这种过量的CGG导致超甲基化最终导致神经元发育所需FMR1的转录抑制12,13]。与脆性X 综合征类似， Rett 综合征是由MECP2 突变引起，MECP2 是一种编码甲基 CpG结合蛋白2 的基因，能够结合靶基因的甲基化CpG 位点，募集转录因子和组蛋白修饰酶(例如组蛋白脱乙酰酶)以激活或抑制基因的转录。然而，目前发现只有约 15%的ASD 病例是在病因学上与已知的遗传异常相关1¹5]。
为了更好地了解特发性ASD占大多数(约80%)的ASD 病例，很多研究使用各种方法搜索ASD 的遗传风险，从集中在特定基因的单核苷酸多态性 (SNP) 分析到全基因组连锁和关联分析。此外，最近应用于ASD 研究的从头合成测序技术试图鉴定罕见和新生基因突变以及与ASD相关的在人类基因组的蛋白质编码区的拷贝数变异。集中在一起，这些遗传研究已产生超过 1000个潜在ASD易感因素，遍布几乎每个染色体上的基因座。然而，尽管有一些例外，在所鉴定的基因/基因座中几乎没有重现性，提示超越外显子序列易感因子的参与。识别其他成分对疾病易感性的作用，促进了关于基因调节表观遗传机制的研究，包括DNA甲基化，组蛋白修饰，染色质重塑和非编码 RNA(见参考文献)。在本章节里，我们回顾了与可能在ASD 发病机制中发挥作用的非编码RNA(ncRNA)相关的一些发现，这些ncRNA 或许可以用作 ASD的潜在生物标志物。

基因组的“黑暗物质”

人类基因组包含30亿个碱基对，但是已知的蛋白质编码基因只占约2%。

第8章在“黑暗”中搜索：非编码RNA 作为新的自闭症研究领域    123

非蛋白编码区域，占据了大约98%的基因组人类DNA,被认为是通过进化事件而失活的“垃圾”。然而，一些研究报道表明大于90%的人类基因组被转录25,虽然其他人认为基因组并没有积极转录，而大多数检测到的转录是由于技术假象和/背景生物噪声产生的。关于基因组的非编码部分(称为 “暗物质”类似于宇宙的黑暗物质)是否被转录并且有功能的争论是很难解决的，因为目前的技术和分析的局限加上非编码区的巨大扩展。使用高度灵敏的平铺芯片对人转录组的选定部分测序，Mercer及其同事(2011)能够识别和鉴定未注释的转录体，其罕见或短暂表达低于常规测序方法的检测阈值。他们的发现有力地支持广泛存在和在非编码中非常复杂的非编码转录区域，有助于解决基因组“黑暗物质”的争议，尽管其生物学意义仍有待探索。
通过研究近150种人类细胞类型，ENCyclopedia of DNA Elements(EN- CODE) 项目汇集了来自世界各地32个实验室的440名科学家，开始对人类基因组的非编码区的功能研究带来了希望。这个巨大的项目研究结果表明约 80%的基因组按照生化活性的定义是有“功能性”的(见参考文献和其他 ENCODE 文件)。他们估计有超过70000个启动子区和在非编码区中接近 400000个增强子。除了启动子和增强子外，ENCODE 研究还发现成千上万的从人类基因组的“暗物质”转录产生但没有编码蛋白的RNA转录体，称为非编码RNA(ncRNA)²8] 。虽然仍然有一些论点，ENCODE的“功能”可能太宽泛，但是现在已变得越来越清楚，这些备受争论、以前被认为是“垃圾”的 DNA部分实际扮演的角色更活跃和重要。

非编码RNA 和ASD

非编码RNA广义地定义为一种不翻译成蛋白质的RNA 转录体。ncRNA 的实例包括在人类中发现的已知功能的转运 RNA(tRNA),核糖体 RNA (rRNA), 微小 RNA(miRNA), 小核仁 RNA(snoRNA),小核 RNA(snRNA), piwi-相互作用RNA(piRNA),小 Cajal 体特异性 RNA(scaRNA) 和长非编码 RNA(lncRNA)。转运RNA和核糖体RNA在人类细胞中高度丰富，其在RNA 翻译过程的功能长期以来被广泛研究和广为人知，因此，这里不再讨论。至
今，只有miRNA,snoRNA和 IncRNA与ASD 及其共患疾病相关。IncRNA的作用也在本书的另一章中讨论。因此，在本章里，我们将只关注miRNA 和 snoR-NA。
miRNA 和 ASD
miRNA是内源性单链非编码RNA分子，长度为19～25个核苷酸，介导转

124    自闭症的异常基因调控：从转录到翻译

录和基因表达的转录后调控。miRNA的生物合成和基因调控机制在许多优秀的评论文章(见参考文献及其中的参考文献)中已经进行了综合描述。不像其他小 RNA,像由 RNA 聚合酶Ⅲ转录的 tRNA,miRNA基因被 RNA 聚合酶Ⅱ转录为初级miRNA 转录体(pri-miRNA), 通常几千个碱基长并包含发夹结构。然后pri-miRNA 被核RNA酶Ⅲ Drosha 通过与DiGeorge 综合征关键区域8(DGCR8) 辅因子作用而修剪成长度约为70个核苷酸(称为前 miRNA)发夹中间体。在Drosha介导的修整之后，pre-miRNA是通过核转运受体exportin-5输出到细胞质，然后由细胞质RNase Ⅲ Dicer加工成约22个核苷酸的miRNA:miRNA* 双链。miRNA 双链中的一个单链掺入含 miRNA 的 RNA诱导的沉默(miRISC)复合物，与目标mRNA转录体结合并形成不完全碱基对，导致mRNA降解，翻译起始的抑制或抑制转录。
miRNA已知在神经系统发育和功能中起关键作用，一些优秀综述及其中的参考文献有详细描述。许多后续小鼠研究的发现也证实miRNA在神经系统发育中的作用³5,36]。此外，miRNA也被发现是有丝分裂后神经元必需的。由于 Dicer 缺乏引起的miRNA 进行性缺失导致Purkinje 细胞死亡，继而导致小脑变性和共济失调的发展37]。此外，在树突棘和突触后密度miRNA 本地化加工器进一步提示miRNA 在神经可塑性中的作用38]。Cohen 等(2011)证明了miRNA, 特别是miR-485,调节树突棘密度，突触齿95(PSD-95) 和神经元表面表达谷氨酸受体GluR2。他们还发现失调的miR485 表达减少自发性突触反应递质的释放，确认miRNA在突触可塑性中的作用。
miRNA 在 ASD病因学和易感性的作用仍不清楚。目前，只有6篇论文与 ASD的 miRNA相关，其中只有4个直接关注miRNA 在特发性ASD患者组织或细胞中的表达。ASD报告中miRNA的完整列表总结在表8-1 中。第一项研究由 Abu-Elneel等(2008)使用多重定量聚合酶链反应(PCR) 分析来自13个ASD患者死亡后小脑皮层组织和13个非ASD患者的对照样品。通过分析466人miRNAs 表达，他们发现与对照组 ASD 样品相比，28个 miRNA 至少在一个 ASD样本中表达明显不同。当对对照中miRNA表达进行反转分析以检测相对于合并的ASD 病例的平均miRNA 差异性表达时，其中9人得到了成功验证。 Buyske(2009)报道，当应用更严格的统计分析重新评估Abu-Elneel等人(2008)的研究结果时，只有两个单独的miRNA 检测到了改变41。

第8章在“黑暗”中搜索：非编码 RNA 作为新的自闭症研究领域    125表8-1发现差异表达或位于与ASD相关的CNV区域中的ncRNA列表

ncRNA 参考文献
ncRNA 参考文献
hsa-mir-103 hsa-mir-153-1
hsa-mir-106a hsa-mir-15a
hsa-mir-106b , hsa-mir-15b
hsa-mir-107 hsa-mir-16-2
hsa-mir-10a hsa-mir-17HG
hsa-mir-10a* hsa-mir-181a
hsa-mir-1180 hsa-mir-181a*
hsa-mir-1182 hsa-mir-181b
hsa-mir-1236 hsa-mir-181c
hsa-mir-124-1 hsa-mir-181d
hsa-mir-124-3 hsa-mir-182-as
hsa-mir-1244 hsa-mir-185 ,
hsa-mir-1248* hsa-mir-186
hsa-mir-125b hsa-mir-188
hsa-mir-1268 hsa-mir-189
hsa-mir-128 hsa-mir-190
hsa-mir-1285-1 hsa-mir-191
hsa-mir-1286 hsa-mir-1910
hsa-mir-129 hsa-mir-1914
hsa-mir-1306 hsa-mir-193b
hsa-mir-132 ,, hsa-mir-194
hsa-mir-1322 hsa-mir-195 ,
hsa-mir-133b hsa-mir-196a
hsa-mir-136 hsa-mir-1972
hsa-mir-138-1 hsa-mir-199a-5p
hsa-mir-139 hsa-mir-199b ,
hsa-mir-140 hsa-mir-200a
hsa-mir-142 hsa-mir-200b
hsa-mir-146a hsa-mir-204
hsa-mir-146b , hsa-mir-205
hsa-mir-148b , hsa-mir-21
hsa-mir-149 hsa-mir-211 ,

126    自闭症的异常基因调控：从转录到翻译

续表

ncRNA 参考文献
ncRNA 参考文献
hsa-mir-212 hsa-mir-451
hsa-mir-216a hsa-mir-455
hsa-mir-216b hsa-mir-455-3p
hsa-mir-217 hsa-mir-484 ,
hsa-mir-219 hsa-mir-486-3p
hsa-mir-223 hsa-mir-486-5p
hsa-mir-23a ,, hsa-mir-489
hsa-mir-23b , hsa-mir-495
hsa-mir-25 hsa-mir-497
hsa-mir-27a hsa-mir-500
hsa-mir-28 hsa-mir-500*
hsa-mir-29b hsa-mir-501
hsa-mir-29B1 hsa-mir-502
hsa-mir-30a* hsa-mir-502-3p
hsa-mir-30c hsa-mir-518a
hsa-mir-320 hsa-mir-519c
hsa-mir-320a hsa-mir-520b
hsa-mir-324 hsa-mir-524
hsa-mir-326 hsa-mir-532
hsa-mir-338-3p hsa-mir-539
hsa-mir-339 hsa-mir-548f-1
hsa-mir-33b hsa-mir-5480
hsa-mir-342 hsa-mir-550
hsa-mir-346 hsa-mir-551a
hsa-mir-34a hsa-mir-552
hsa-mir-362 hsa-mir-563
hsa-mir-363 hsa-mir-564
hsa-mir-367 hsa-mir-570
hsa-mir-376a-as hsa-mir-571
hsa-mir-381 hsa-mir-577
hsa-mir-429 hsa-mir-589
hsa-mir-431 hsa-mir-590
hsa-mir-432 hsa-mir-591

第8章在“黑暗”中搜索：非编码RNA 作为新的自闭症研究领域    127

续表

ncRNA
参考文献
ncRNA
参考文献
hsa-mir-597 SNORA30
hsa-mir-598 , SNORA41
hsa-mir-605 SNORA49
hsa-mir-629 SNORA59A
hsa-mir-630 SNORA67
hsa-mir-647 SNORA70F
hsa-mir-649 SNORD101
hsa-mir-650 SNORF116
hsa-mir-651 SNORD12C
hsa-mir-652 SNORD13
hsa-mir-653 SNORD14E
hsa-mir-660 SNORD15A
hsa-mir-663 SNORD1C
hsa-mir-671 SNORD28
hsa-mir-7 SNORD29
hsa-mir-7-3 SNORD31
hsa-mir-873 SNORD33
hsa-mir-876 SNORD35A
hsa-mir-92 SNORD3A
hsa-mir-920 SNORD41
hsa-mir-93 , SNORD44
hsa-mir-941-1 SNORD5
hsa-mir-941-2 SNORD50A
hsa-mir-941-3 SNORD54
hsa-mir-943 SNORD55
hsa-mir-944 SNORD57
hsa-mir-95 SNORD58A
hsa-mir-LET7F1 SNORD68
SNORA21 SNORD76
SNORA25 SNORD95

128    自闭症的异常基因调控：从转录到翻译

Talebizadeh等(2008)利用淋巴母细胞样细胞系(LCLs) 对来自6名ASD 个体和6名性别和年龄配对的对照组中470成熟的miRNA 进行表达谱分析42】。发现在470个miRNA 中，与对照组比较，他们观察到9个miRNA 在 ASD个体中有差异表达。有趣的是，4/9的miRNAs 与 Abu-Elneel等人(2008) 在小脑皮质组织中发现的差异表达miRNA 重叠，提示至少一些在外周组织中检测到的分子异常与来自ASD个体脑组织的相呼应。然而，这两个研究都没有实验验证差异表达的 miRNA 的基因靶标。这使得在他们发现的 ASD miRNA 失调与其生物学功能破坏的相关性上遇到了巨大的挑战。
我们实验室的后续研究整合分析了来自5个相同 ASD 的 LCL 和9个未受影响的双胞胎或兄弟姐妹对照组miRNA 表达谱与mRNA 表达谱[43】。使用具有相同或相似基因型的LCL 允许我们用最小的遗传学异质性来研究表观遗传学差异。本研究发现来自ASD个体LCL中的miRNA与他们的未受影响的双胞胎或兄弟姐妹存在43个差异表达基因。有趣的是，这些miRNA 中至少有16个已知与脑相关。此外，一些miRNA 调控(例如miR-23a的上调和在本研究中观察到的miR-106b的下调也是与以前在 Abu-Elneel等(2008)使用死后小脑组织的研究结果一致。这些发现支持在ASD个体的外周组织发现的一些分子异常，特别是血液中观察到变化，可能反映这种疾病在大脑中的病理生理状况。此外，使用miRBase数据库对每个差异表达miRNA的潜在靶基因制表[44,并手工选择mRNA 表达水平与其相应的调节miRNA 呈负相关表达的靶基因。使用这个整合组学方法，在ASD中，我们能够识别多达1053个潜在地受差异表达的miRNA调节的基因。为了验证miRNA芯片数据，我们选择4 个差异表达的miRNA(即，hsa-miR-219-5p,hsa-miR-139-5p,hsa-miR-29 和hsa- miR-103)用于定量逆转录聚合酶链式反应(qRT-PCR) 分析。qRT-PCR分析证实，与他们未受影响的双胞胎或兄弟姐妹对比，来自ASD 个体的LCL 中 hsa- miR-219-5p和 hsa-miR-139-5p 发生上调及 hsa-miR-29b 和 hsa-miR-103 的下调。此外，经过qRT-PCR 验证的脑特异性 miRNA(hsa-miR-29b 和 hsa-miR- 219-5p)的两个可能的靶点基因(ID3 和 PLK2)也通过miRNA过表达或敲落实验得到验证。这些mRNA 和 miRNA 表达水平的比较在不和谐的双胞胎之间和病例对照同胞显示反向关系，进一步表明ID3和 PLK2 是 miRNA各自的体内靶标。
类似于Sarachana 等人(2010)的研究，Ghahramani Seno 等人(2011)对来自24个ASD及其未受影响的胞弟/胞妹对的LCL进行基因和miRNA表达谱分析。他们在24个同胞比较对中发现至少12个人中出现了12个差异表达 miRNA。通过基因表达来减小样本异质性，他们能够在亚组中识别13个差异表达miRNA 与基因表达谱相似。其中6个(即hsa-miR-486-5p,hsa-miR-

第8章在“黑暗”中搜索：非编码 RNA 作为新的自闭症研究领域    129

486-3p,hsa-miR-548o,hsa-miR-10a,hsa-miR-10a* 和 hsa-miR-199b-5p) 与以前的分析重叠。有趣的是这6种miRNA的 P 值的大大改善，说明通过基因表达谱来减少ASD 样品异质性的方法是有效的。
至今ASD 血液样本的最大转录组分析是由Kong等人(2012)实现的。他们使用了170例ASD病例及115个年龄和性别匹配的对照。样本被分配到两个队列。第一队列66个男性ASD病例和33个年龄-匹配的男性对照，结果显示ASD 与对照组比较，489个转录本存在差异性的表达。虽然本研究的后续分析主要集中在蛋白质编码转录本的差异，而不是ncRNA,有趣的是，hsa-miR-17hg和 hsa-miR-223 在ASD 血液中也存在差异表达。验证队列使用104 个 ASD 和82个对照，结果显示ASD 病例和对照之间存在610个差异表达的转录本。在 ASD 血液样品中，转录本 hsa-miR-142,hsa-miR-29b和 hsa-miR-let7f1 与对照比较，发生失调。有趣的是，Sarachana 等(2010)还确认了hsa- miR-29b在ASD 个体的LCL中与对照比较显著上调[43,表明在ASD 病例的 LCL 中观察到的至少有一些miRNA失调可以反映ASD血液病理-生物情况，因此，支持使用LCL来研究在ASD中 ncRNA的作用的可行性。除了miRNA之外，Kong等人也发现了一些 snoRNAs 在 ASD个体的血液中差异表达。他们的发现和snoRNA在 ASD 中的作用将在下一节详细讨论。
如前所述，几乎所有关于ASD的遗传研究都主要集中在基因组的蛋白质编码区。然而，越来越明显的是非编码区域不可忽略，因为现在已知它们会在调节基因表达中发挥重要的作用。因此，Vaishnavi等(2013)探索了涉及ASD 的 CNV基因座和确认位于这些区域中的miRNA试图阐明miRNA存在于ASD 相关的CNV 基因座中生物学和功能意义。除了这3种miRNA, 那些位于ASD 相关的CNV 基因座，并在独立队列组中的ASD 差异表达的miRNA包括hsa-miR-7,hsa-miR-484,hsa-miR-500,hsa-miR-502和 hsa-miR-59840,45]。
snoRNA 和 ASD
snoRNA是小的非编码RNA 分子，为60～600核苷酸长度(多数在70~

130 自闭症的异常基因调控：从转录到翻译

200核苷酸范围内),主要调解转录后修饰其他RNA, 特别是rRNA,tRNA 或 snRNA。snoRNA包括两个家族，即C/D 和 H/ACA, 基于RNA分子中保守序列基序的。在boxC/D家族RNA包含PuUGAUGA(box C)和 CUGA(box D) 序列基序，位于5'和3′末端，而在box H/ACA组中的RNA在中间含有序列基序ANANNA(box H)和在3′末端附近的高度保守的ACA(boxACA)。大多数已经在人类中得到确认和鉴定的snoRNA位于基因的内含子区域编码参与核糖体生物形成的蛋白质。在基因间区域检测snoRNAs比在内含子区域检测更困难。因为在这些ncRNA 基因中缺乏起始和停止密码子的提示序列。然而，发现越来越多的snoRNAs衍生自作为多顺反子的基因间区转录本，每个可以产生多达十个不同的成熟核酸内切酶切割后的ncRNA。一些snoRNA也是独立转录并经过转录后修饰，特别是像mRNA 和 snRNA一样的5′甲基化和超甲基化。因此，随着测序技术和生物信息工具的改进，推测还有更多包括内含子和基因间的snoRNA和其他ncRNA在“暗物质”中被发现。
相比miRNA,人们对snoRNA的生物学功能还不甚了解。然而，最近的研究已经开始阐明snoRNA在神经和发育中的作用。据报道，几种snoRNA,包括 SNORA35(HBI-36),SNORD64(HBII-13),SNORD115(HBII-52) 和 SNORD116 (HBII-85),在人类中枢神经系统中特异性表达或高度表达。并发现 SN-ORD12,SNORD29,SNORD31,SNORD74,SNORD101,SNORD104 和 SNORD115 在胚胎干细胞神经分化过程中高度富集和差异表达52],提示这些 snoRNA参与神经发育。小鼠同源SNORD115 包含高度保守18-核苷酸序列与血清素2C 受体互补 mRNA 转录体，表明这种 snoRNA 可能在调节5-羟色胺2C 受体 mRNA的加工中发挥重要的功能51]。
snoRNA的阻断与人类的神经发育紊乱相关。 SNORD115和 SNORD116 定位到Prader-Willi综合征位点。Prard-Willi 综合征(PWS)是一种由来自父系遗传的15q11-q13 区域染色体基因结构损失或表达缺失引起的遗传性疾病。值得注意的是，PWS是一种已知的ASD 合并疾病伴随例如语言和运动发育的延迟和学习障碍。除了这些领域的缺欠，许多具有PWS的个体也表现出重复的行为和ASD 的社会缺陷。SNORD116 的微缺失与PWS相关并可能导致PWS和ASD之间共享的病理状况，包括新生儿低血压、进食困难、睡眠呼吸暂停、语言和整体发育延迟。有趣的是注意到患者 SNORD116 微缺失在 Sahoo及其同事的研究中(2008)也是如此报告符合基于自闭症的诊断观察计划(ADOS) 和自闭症诊断面试修订(ADI-R) 评估工具的自闭症的定义标准。
目前只有几个直接的snoRNAs 与 ASD 相关性的报告，可能是由于缺乏生物信息学工具和人类snoRNA 的综合数据库造成的。使用包含寡核苷酸探针的 ncRNA芯片针对人类miRNA 和 snoRNA,我们的实验室观察到来自ASD个

第8章在“黑暗”中搜索：非编码RNA 作为新的自闭症研究领域    131
体的LCL 中的许多 ncRNA 失调。除了前面提到的miRNA, 我们发现 ASD个体中有 6 个 snoRNA 显著差异表达。这些 snoRNA 包括 SNORA25
(ACA25),SNORA30(ACA30),SNORA41(ACA41),SNORD5(mgh28S-2410),
SNORD29(U29) 和 SNORD116。值得注意的是发现SNORD116 在 ASD 中相对于对照显著降低，表明功能丧失引起的SNORD116破坏可能在PWS和 ASD 共同的病理生理学中发挥重要作用。由Kong和同事(2012)进行全血转录组学分析揭示了ASD个体的血液中许多snoRNA存在差异表达(表8-1)。有趣的是，已经发现snoRNA包括SNORD12,SNORD31 和 SNORD101,在神经分化期的胚胎干细胞中差异表达【⁵2,提示在血液中观察到的snoRNA的异常表达可能反映脑中类似的变化，可能是由于整体或系统ncRNA的失调导致的。
与 ncRNA相关的生物学功能
有趣的是，许多发表的与脑特异性和大脑相关的miRNA表达研究发现 ASD个体的血细胞和大脑中存在共同的显著差异表达ncRNA 。5个鉴定为脑特异性的miRNA 包括hsa-miR-29b⁵7],hsa-miR-15357],hsa-miR-199b,hsa- miR-21957,58,和 hsa-miR-326⁵9] 。已经发现一些在脑中高度表达的miRNA, 比如hsa-miR-132 和 hsa-miR-139, 在其他组织中却低表达。此外，报告10个与脑发育和功能高度相关的miRNA 包括 hsa-miR-1657,hsa-miR-23a³7],hsa-
miR-23b⁶0],hsa-miR-30c⁵7,hsa-miR-10357],hsa-miR-106b⁴0],hsa-miR-
10761],hsa-miR-136³7】,hsa-miR-191⁵9和 hsa-miR-211³7] 。ASD 大脑特异性和脑相关miRNA强烈地表明在患有ASD的个体中被破坏的ncRNA 可能在神经功能中起重要作用。
为了了解在ASD中由于ncRNA 差异表达造成的生物功能破坏，通过In- genuity(IPA;www.ingenuity.com) 系统，一个是人工收录的生物网络预测程序，对合并所有研究报道明确的ASD相关的ncRNA进行信息通路分析。然后使用 Fisher exact检验法确定在网络中显著性呈现的生物功能和疾病(P<0.05)。
报道的ASD个体ncRNA生物网络预测显示与发育障碍、遗传性疾病、炎性疾病和神经性疾病心理障碍的显著关联(表8-2)。有趣的是，与在 ASD中 ncRNA有关的遗传性疾病还包括杜氏肌营养不良(例如hsa-miR-30,hsa-miR-133,hsa-miR-146,hsa-miR-148和 hsa-miR-199),X-连锁遗传疾病(例如 hsa- miR-30,hsa-miR-133,hsa-miR-146,hsa-miR-148 和 hsa-miR-199),DiGeorge 综合征(例如 hsa-miR-650,hsa-miR-1286和 hsa-miR-1306),精神分裂症(例如 hsa-miR-29b,hsa-miR-30,hsa-miR-92,hsa-miR-103 和 hsa-miR-146),唐氏综合征(例如hsa-miR-10 和 hsa-miR-125), 和癫痫(例如hsa-miR-146) 。所有这些都是已知的ASD的共病性疾病[62-67】。这个发现表明这些ncRNA的异常表达

132 自闭症的异常基因调控：从转录到翻译

可能导致与ASD共有的病理生理异常。此外，IPA 分析还揭示了多达353个已被实验验证的在ASD 中差异表达的ncRNA 调节的基因。这些靶基因的 IPA 分析显示这些在ASD中失调ncRNA 的靶基因与神经系统发育和功能(P =9.53×10-¹⁶~3.94×10⁻⁹),包括大脑皮层的发育、神经元分化和神经突生成等显著相关。特别是，与ASD中的行为缺陷，以及多达62个与学习和记忆相关的基因也与这些实验验证的ncRNA 靶基因(P=3.05×10-¹⁴~6.20×10⁻⁹)       相关。此外，ncRNA的靶基因也参与PTEN 信号传导(P=2.23×10-¹⁵),    神经调节蛋白信号传导(P=7.63×10-¹²),PI3K/AKT/mTOR       信号传导(P=1.28×10⁻¹¹)
和神经营养因子/TRK 信号传导(P=3.43×10-¹¹),       所有这些都与 ASD 相关68-71]。值得注意的是，353个基因中的至少21个被认为是ASD 候选者基因并且已经存储在 AutDB 48 数据库中[48J,AutDB 是一个人工收集编译的 ASD 数据库(表8-3)。ASD 候选基因和与生物学功能有关的基因的富集以及与 ASD相关的疾病中受ncRNA 的靶基因提示 ASD个体中ncRNA的异常表达可能导致ASD 候选基因的失调，从而造成ASD病理生理状况。
表8-2由Ingenuity 信息通路预测与ASD中报道的ncRNA显著
相关的疾病和功能分析

P值 ncRNA数量
重大疾病
发育障碍 4.89×10⁻⁴0~2.79×10-² 36
遗传性疾病 4.89×10=⁴⁰ ~1.87×10-² 42
骨骼和肌肉疾病 4.89×10-⁴0～2.79×10-² 34
癌症 4.33×10-³¹~4.73×10~² 64
生殖系统疾病
其他重大疾病 4.33×10-³¹~4.73×10-² 45
炎症性疾病 1.29×10⁻²²~9.32×10-³ 41
神经疾病 1.06×10⁻⁸~1.39×10-² 21
心理障碍 1.06×10⁻⁸~1.03×10-² 18
神经系统开发和功能 4.67×10⁻⁸ ~2.73×10⁻² 3

ASD 生物标记物研究的未来方向

虽然许多关于ASD的研究工作都集中在搜索蛋白质编码的基因和遗传变

第8章在“黑暗”中搜索：非编码RNA 作为新的自闭症研究领域    133

异，基因组的变化越来越清楚，非蛋白质编码部分也值得注意。如前所述，很多基因组的非编码区含有基因调节元件，特别是各种ncRNA, 其中许多已被发现在血液和/或具有ASD 个体的大脑中失调。 ASD 个体血细胞中与大脑相关的ncRNA 变化表明在外周组织中观察到的ncRNA 表达改变可能反映一些发生在神经系统中的病理生理状况，从而支持使用外周细胞，尤其是血细胞，作为用于自闭症研究ncRNA 和基因表达的替代组织，为探索ncRNA 可能作为这种疾病的生物标志物的研究提供了方便。
表8-3 AUTDB48 数据库中已经由IPA 经实验验证为 ASD中失调的ncRNA
靶标的ASD候选基因

符号
Entrez基因名称
调节性ncRNA
ALOX5AP 花生四烯酸5-脂氧合酶激活蛋白 hsa-miR-199a-5p
ATRX X连锁α地中海贫血/智力迟钝综合征 hsa-miR-30c
BCL2 B细胞CLL/淋巴瘤2 hsa-miR-181a
CAMTA1 钙调蛋白结合转录激活子1 hsa-miR-129
DCX 双皮质素 hsa-miR-128
ESR1 雌激素受体1 hsa-miR-181a
FBXO33 F-盒蛋白33 hsa-miR-451
FMR1 脆性Xmental阻滞1 hsa-miR-30a*
GPD2 甘油-3-磷酸脱氢酶2(线粒体) hsa-miR-30c
HDAC4 组蛋白脱乙酰酶4 hsa-miR-29b
ITGB3 整联蛋白，β3(血小板糖蛋白iiia,抗原CD61 hsa-miR-92
JARID2 Jumonji,AT富交互式域2 hsa-miR-125b
MET Met原癌基因(肝细胞生长因子受体) hsa-miR-30c
NFIA 核因子IA hsa-miR-103
NTRK3 神经营养性酪氨酸激酶，受体，3型 hsa-miR-128
PTEN 磷酸酶和张力蛋白同源物 hsa-miR-92
RBM8A RNA结合基序蛋白8A hsa-miR-125b
RELN Reelin hsa-miR-128
RERE 精氨酸-谷氨酸二肽(RE)重复 hsa-miR-29b
SLC4A10 溶质载体家族4,碳酸氢钠转运蛋白，成员10 hsa-miR-30c
SYNE1 含有Spectrin重复，核膜1 hsa-miR-7

134    自闭症的异常基因调控：从转录到翻译

虽然在基因组“暗物质”中搜索 ASD 生物标志物可能是一个非常有前途的途径，ncRNA生物标记物发现主要挑战之一就是由于这种疾病的高度异质性而在独立队列中缺乏重复性。如上所述，受影响个体的严重程度可能因人而异。当分析一个显示各种临床表型的不同病例组每个“亚表型”在不同研究中的比例可能会导致不可重现或没有显著意义的发现。因此未来的ncRNA研究，应该根据其临床表型、具体性状甚至合并症等对ASD 进行亚型分类，以减少其异质性，来解决这个问题。这一战略，通过许多最近的全基因组关联研究证实，不仅能提高统计力度非常有用。因此，对ASD受试者可能进行亚型分类来确认ncRNA生物标志物可能在未来的生物标记物发现研究中非常有益。
ncRNA 研究的另一个重要挑战是缺乏人类ncRNA的综合数据库。直到最近，大多数涉及ASD的 ncRNA研究只有 miRNA,部分是因为miRNA的生物信息学工具和数据库已经被广泛开发并且比其他类型的ncRNA 相对来说更完备。但是，计算技术的进步为其他类型的ncRNA带来了先进的生物信息学工具。比如snoRNABase,其是用于人box H/ACA 和 C/D snoRNA的综合数据库 8 。IncRNA db提供真核生物长链非编码RNA 综合注释81],和sno/scaRN-Abase是一个sno/scaRNA, 收集整理后的数据82]。这些新的ncRNA 数据库将因此促进研究和解释ASD 所有类型ncRNA表达的变化。因为已知ncRNA,特别是在不同组织中具有可变表达的miRNA 能够影响许多靶标基因的转录和翻译，它将有助于研究在同种组织中ncRNA的表达变化与靶标基因协同表达的变化整合起来。整合这些研究的结果将有助于研究人员识别ASD个体中因 ncRNA失调而受负面影响的组织特异性生物学通路，继而可以帮助我们更好地理解与ASD相关的病理生理状况。

本章要点

● ASD是遗传度最高的精神疾病之一；但是到目前为止，在基因组编码区没有一个单基因突变或SNP占到ASD病例的1%~2%以上。
●越来越清楚地表明，非编码区基因组对于基因调控是很重要的。但是对 ASD非编码部分基因组的研究非常少。
●一些关于ncRNA 的研究表明ncRNA 在 ASD 的个体中失调。但是，可能是由于ASD 的高度异质性，只有几个所发现的ncRNA 在独立队列中是可重

第8章在“黑暗”中搜索：非编码RNA 作为新的自闭症研究领域    135

复的。
●未来对ASD 中 ncRNA 的研究应考虑根据临床表型和/或其他判断标准对个体进行亚群分类以减小异质性。这个策略将允许对ASD 的不同亚组进行ncRNA生物标志物的确认，也能使不同的研究进行比较。
●改进生物信息学工具和数据库将有助于除了miRNA, 如 snoRNA,scaRNA 和IncRNA 之外更多类型的ncRNA的研究。
●整合ASDncRNA表达与生物学表型，如失调的靶基因和生物功能将有助于识别它们受到ncRNA 调节异常影响的通路和网络。

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第 9 章

针对非编码 RNA 治疗自闭症谱系障碍

Jessica    DeWitt,Daniel    B.Campbell 潘娜译，丁岩孔学君校

摘要
一个全新的药理学领域正在从对内源性功能性长非编码RNA(lncRNA) 的理解中发展而来↓。癌症、糖尿病和艾滋病的潜在治疗方案，可以把调节基因网络的特异性 IncRNA 作为靶点进行靶向治疗。最新证据表明特异性 lncRNA增加自闭症谱系障碍(ASD) 风险。在这里，我们评估这个证据，探讨基于抑制性RNA的疗法来治疗ASD的可能治疗进展。
关键词：长非编码RNA;lncRNA; 非编码RNA;ncRNA;siRNA;反义治疗。

IncRNAs 参与ASD 的证据

自闭症谱系障碍(ASD) 是一种高度可遗传的神经发育障碍，其特征在于社会交往、语言发展和行为灵活性的缺陷。虽然环境因素有参与ASD,但 ASD 的遗传率估计>70%。因此，遗传方法为探知影响 ASD的决定性因素提供了美好的前景。最近的全基因组方法已经确定了可能携带罕见突变的连锁区【5,61、染色体区域与全基因组显著关联和罕见的蛋白编码基因突变13-18]。然而，在这些强大的全基因组方法中，在鉴定的基因中存在非常少的重叠，并且可再现的候选基因的可靠性也似乎不确定。
正如和所有常见的复杂遗传疾病一样，关于罕见和常见遗传变异对 ASD 致病的相对权重也存在争论。在2p,7q,15q 和16p 染色体上罕见的新生拷贝数变异体(CNV) 的确认为罕见变异体和重要生物学线索导致ASD 的病因学

142 自闭症的异常基因调控：从转录到翻译
基础提供了支持。然而，这些尽管大量的队列收集和技术进步使CNV 检测分辨率增加10倍21,但CNV 仍保持在<6%的病例(每个CNV 被观察到<1%)。现在清楚的是，CNV 导致的 ASD 只占一小部分22]。另外，牵涉的 CNV 通常是大的(约250kb)并且包括多个蛋白质编码基因，使得难以确定哪个基因导致疾病。全基因组关联研究(GWAS)已被证明可有效识别其他复杂遗传疾病，如2型糖尿病、克罗恩病和前列腺癌相关遗传变异。然而， GWAS应用于ASD产生了混合结果⁶-9]。因为GWAS是用于鉴定大效应相关的常见变体的确定技术，GWAS 提示的缺乏明显蛋白质编码基因将ASD 遗传学领域推向寻找罕见的致病变异。整体外显子组测序(下一代测序局限在蛋白质编码基因的外显子)在鉴定孟德尔病症中的致病性遗传变异已经证明是有效的，例如米勒综合征，高度近视和皮质发育的不良畸形。然而，ASD 整个外显子组测序也产生了混合结果13-18】。整个外显子测序方法可以确定特定于ASD个体的新生突变，但新生突变对于大部分病例没有重现性。因此，确定性实验尚未解决常见变异与罕见变异的争论，并表明常见变异和罕见变异都与ASD的风险有关。
基于各种证据，我们认为常见变异可能在ASD风险中发挥重要作用。首先，ASD的高遗传性表明，外显子测序和CNV 检测涉及的新生突变在疾病中发挥很小的作用。第二，亚临床ASD 性状存在于受影响个体的家庭成员的> 50%中36-39],提示常见的遗传因素导致大部分病例。第三，ASD 性状的遗传性高，并且在极端情况和一般人群之间是不可区分的，表明这些性状是神经发育连续体的定量极端，而不是突变诱导的异常。第四外显子测序得出的结论，没有任何一个单一致病基因独立起作用，但是数百个基因变化一般会增加患病风险,表明每个遗传变异与疾病关联的证据依然是最重要的。虽然全基因组常见标记的关联性可能随着更多的基因分型而发生漂移，但该关联可能保持显著。相比之下，罕见变体显著的关联可以随单个对照中阳性突变的出现而消失。虽然常见变体的遗传效应大小可能很小，但类似的效应大小已经成功确定了克罗恩病和2型糖尿病的治疗靶标。
外显子组测序研究都得出结论，没有单一基因导致 ASD,而400~1000种不同基因可能增加 ASD 风险。这些数据的另一种解释是蛋白质编码基因的新生突变可能对 ASD几乎没有贡献。相反，影响lncRNA的遗传变异 (从外显子测序研究中排除)可能有实质性贡献。三条证据支持这种解释。首先，虽然个体常见遗传变异对ASD的风险较小，但共同的遗传变异解释了超过 40%的ASD遗传风险。其次，高密度脂蛋白(HDL) 的大规模全基因组测序表明非编码区域对蛋白质编码基因贡献与这种复杂的遗传状况一样多。
第三，所有人类大脑中长的转录体中近2/3(64%)是IncRNA⁴4] 。日益明显的

第9章针对非编码RNA 治疗自闭症谱系障碍 143

是，被编码的ncRNA数量在基因组中随着发育复杂性增加，并且人类lncRNA 内的遗传变异与神经发育障碍相关46]
与这些遗传现象同时发生，IncRNA的贡献在其他复杂的遗传疾病变得更加明显，包括癌症和精神分裂症[49】。来自多种新兴方法的证据表明In- cRNA对 ASD的贡献。
lncRNA可能参与ASD 的第一个证据来源于X 连锁蛋白编码基因的研究。Noor 等人发现0.5%的个体在编码蛋白质的PTCHD1基因中具有突变。另外0 . 5%的ASD病例也在与ASD相关的PTCHDI 基因座5’处缺失复合非编码 RNA 基因座 (PTCHD1AS1/PTCHD1AS2) 。尽管缺失是罕见的，并且PTCHD1ASI 和 PTCHDIAS2 的功能机制非编码RNA 尚未被广泛研究，它们被认为是调节反链上的蛋白质编码基因的表达，PTCHDI。
第二个报告指示lncRNA 对 ASD的贡献是基于全基因组的显著关联一个染色体5p14.1 的蛋白编码基因较差的区域。ASD 的全基因组显著关联研究 (GWAS) 表明，对于染色体5p14.1 上的rs4307059, 是迄今为止最重要的关联(P=10-¹⁰) 。同样的rs4307059 等位基因也与一般群体样本中的社会交际表型相关。然而，rs4307059基因型与侧翼蛋白编码基因(CDH9 和 CDH10⁷)) 的表达不相关。我们鉴定了直接转染到染色体5p14.1ASD GWAS 峰的位点的3.9kb非编码 RNA⁵¹ 。非编码RNA由 moesin pseudogene1(MSNP1)的相反 (反义)链编码，因此称为MSNPIAS(moesin pseudogene1,反义)。MSNPIAS 与 X 染色体其编码调节神经元结构和免疫应答的蛋白质(moesin)MSN具有94%的相同序列并且是反义的。 MSNP1AS在 ASD个体死后的皮层中的表达增加12.7倍，在具有 rs4307059 风险等位基因的个体中增加22倍。 MSNP1AS非编码RNA结合MSN,并且其在培养神经元中的过表达导致显著的MSN转录体，moesin 蛋白，神经突数量和神经突长度的降低。因此，基于GWAS的发现，我们的发现揭示了功能性lncRNA增加ASD 风险。
为了评估IncRNA 表达的变化是否是ASD发病机制的一部分，使用芯片分析来自ASD 和对照前额叶皮层和小脑死后脑组织的33000个IncRNA 和 30000个mRNA转录体。在ASD 中有200个IncRNA 差异表达。以前，据报道ASD 脑中的mRNA转录是同源的。另一项研究也发现ASD 脑中 lncRNA的转录同源性增加。尽管本研究的结论涉及IncRNA, 但样本量很小 ( 2 例ASD 病例和2个匹配的对照)。更大的样本研究将是必要的，以确定在ASD大脑中的特定IncRNA具有一致改变表达。因此，从多个实验方法积累的证据表明lncRNA 参与ASD。以 IncRNA为靶向的新药理学前景提示可能的治疗选择。

144    自闭症的异常基因调控：从转录到翻译

什么是ncRNA?

真核基因组比以前的认识要复杂得多。编码蛋白质的基因外显子占<2%的总基因组。然而，转录组分析显示人类基因组差异和动态转录产生所有形状和大小的非编码RNA(ncRNA) 谱[55。NcRNAs根据其大小被分为两类：长ncRNA(长度大于200个核苷酸)和短ncRNA(长度小于200个核苷酸)[56。这些类别可以基于其他性质进一步分为子类别。ncRNA 的功能大多不清楚。然而，已经发现的功能显然是发育和器官维持的重要部分。当这些ncRNA出现失调时，作为细胞过程的关键部分，它们使得生物体易受疾病的影响。已经显示几种ncRNA在诸如癌症、HIV、心脏病和神经障碍等疾病的发病机理中起作用。功能鉴定这些细胞成分对我们理解这些疾病是很重要的，可以探知其的发病机理和治疗。
小非编码RNA
小 ncRNA作为一类，包括RNA 如微小RNA(miRNA), 短干扰RNA(siR- NA), 小核仁 RNA(snoRNA)和PIWI 相互作用RNA(piRNA) 。编码这些RNA 的基因可以在整个基因组中找到。小的ncRNA 也可来自IncRNA的加工58]。小的ncRNA用于调节基因组的主要方法是通过互补核苷酸序列结合其特异性的靶标转录体，改变下游事件以影响靶标的翻译。要阅读更多关于小 ncRNA亚类，生物发生和遗传调控的形式，请参阅以下综述57,60-64]。
MiRNA是研究最深入的小 ncRNA 类别之一，首次发现于1993年 (C.elegans) 。自从其发现以来，miRNA被认为在脊椎动物中相对保守。MiRNA可以通过结合通常是抑制翻译的靶转录体的3'-UTR⁶9或 5'-UTR70 来调节基因的翻译后的功能。一个特定的miRNA 可以有多个靶标转录体，一个转录体可以被多个miRNA调节⁷¹]。超过60%的人类蛋白质编码基因是miRNA的预测靶标，借此证明miRNA 在人类基因组中是普遍的和重要的。miRNA的调节对哺乳动物发育过程至关重要，并且像许多其他 ncRNA一样，miRNA表达可以在整个组织类型和发育过程中特异地和差异地表达73-75]。
如同miRNA,siRNA也结合靶标转录体上的互补序列并调节基因表达。区别在于siRNA 互补序列具有更严格的要求，因为它们必须具有接近完美的序列互补。由于这种差异，siRNA 和 miRNA 具有两种独立的抑制机制。 siRNA与有非常紧密互补序列结合并经过直接切割，同时miRNA 靶标被去稳定化或被转录性抑制。内源siRNA(endo-siRNA) 据称在果蝇的体细胞组

第9章针对非编码RNA治疗自闭症谱系障碍 145

织中防止转座子和dsDNA 病毒。Endo-siRNA也已经在小鼠83-86和人类细胞中被鉴定出来。
长ncRNA(IncRNA)

LncRNA是一个广泛的类别，包括许多不同的结构特征和作用机制。Ln- cRNA包括假基因、基因间区域(lincRNA) 和蛋白质编码基因中的有义链和反义链。转录后，可以通过剪接和/或加入5′-甲基-鸟苷帽和3′多聚腺苷酸(A) 尾进一步加工它们。它们还可以包含将它们导向细胞质或细胞核的定位信号。LncRNA 还具有许多不同的功能作用，例如采用增强子样功能，参与染色质修饰复合物的募集，调节选择性剪接，提供用于组装蛋白质复合物的支架，并且充当竞争内源性RNA(ceRNA)9294] 。XIST以及其与polycomb抑制复合物PRC2 的相互作用是研究最彻底的lncRNA[⁹51。XIST的反义基因TSIX,发现于1999年。TSIX是 XIST的调控要素。它以及其他多能性因子是抑制途径的一部分7]。在lncRNA 可用于治疗疾病之前，需要很多关于它的发现要做。

ncRNA 的靶向治疗：一种新型药理学

ncRNA用作治疗靶标的主要疾病是癌症、艾滋病和糖尿病。利用lncRNA 设计用于靶向IncRNA的疗法有多种方式，包括使用它们作为生物标志物，使它们的表达受到抑制，或诱导它们过度表达。因为涉及癌症的许多IncRNA 导致细胞增殖，所以癌症的主要治疗方法是抑制，但是越来越多的研究专注于过表达和作为生物标志物的用途，以用于治疗其他疾病。
癌症
lncRNA的失调是癌症的一个主要特征，因为lncRNA 控制其他细胞过程。 LncRNA 涉及许多白血病和癌，包括慢性淋巴细胞白血病、结肠直肠癌和肝细胞癌。当与相应的正常细胞比较时，恶性癌细胞具有一组独特表达的超保守区。数据表明翻译的超基因区域的表达的变化参与癌症形成98]。已经受到广泛关注的编码IncRNA的特异性基因包括MALAT1,HOTAIR 和 PTENTP1等(表9-1)。
从2004年开始试验抑制miRNA,当 Meister 等人使用2'-0-甲基寡核糖核苷酸特异性失活miRNA-蛋白复合物RNAi的活性。抑制lncRNA 可能比抑制miRNA 更困难，可能是因为它们更大。然而，用siRNA 抑制lncRNA 是可行

146    自闭症的异常基因调控：从转录到翻译

表9-1 IncRNA潜在治疗靶点

临床诊断
IncRNA
自闭症谱系障碍癌症
前列腺癌
乳腺癌
肝细胞癌
脊髓小脑共济失调阿尔茨海默病
脆性X综合征
唐氏综合征 PTCHD1AS1/PTCHD1AS253,MSNPIAS55
MALATI DD3
BC1
Mlbn1
BACE1/BACE1-AS110] FMR4
NRON117】,XIST118

的。该方法已被用作涉及癌症的lncRNA 的治疗方法。转移相关肺腺癌转录体 1(MALAT1)是涉及许多不同类型的癌症的增殖和转移的lncRNA 。Guo等首次研究MALAT1 在宫颈癌发病机制中的作用。他们通过使用siRNA有效地沉默MALAT1,证明lncRNA可以是治疗靶标。阻断MALAT1或参与癌症进展的其他 IncRNA 是一种有希望的治疗方法，因为许多IncRNA已经用siRNA 沉默[100。
已经广泛研究的第二种癌症IncRNA是 HTAIR,一种Hox 转录反义基因间 RNA。具有增加的HOTAIR 表达的结肠直肠癌患者更可能通过增加细胞侵袭和促进转移具有不良预后。非小细胞肺癌(NSCLC)细胞中HOTAIR 的强制过表达导致癌细胞增殖和迁移的增加。相反，HOTAIR的丧失可以抑制肿瘤发生和转移，说明HOTAIR是癌症进展调节蛋白并可以促进肿瘤发生和进展。HOTAIR帮助PRC2复合物靶向特异性基因，其使H3K27 三甲基化并沉默转移抑制基因。HOTAIR 和PRC2是相互依赖的，这意味着高HOTAIR 表达可以是对PRC2抑制剂敏感的癌症的生物标志物。相比之下，具有高PRC2表达的肿瘤可能对靶向HOTAIR 或阻止HOTAIR 与PRC2 相互作用的治疗敏感。这些数据表明，通过lincRNA的重编程可以用于具有异常lincRNA 表达的任何疾病的治疗103]。
与PTEN(肿瘤抑制基因)同源的假基因PTENP1被 miRNA 靶向和沉默。 PTENP1 可以通过结合PTEN miRNA来正调节PTEN 和去抑制 PTEN。siRNA 也已被用于沉默PTENP1 和 PTEN104]。使用siRNA 沉默参与癌症的lncRNA 是靶向治疗的有效方法。

第9章针对非编码RNA治疗自闭症谱系障碍 147

基于单独的表达水平，LncRNA可以用作癌症的生物标志物。DD3是描述最多的前列腺癌特异性IncRNA, 并且是癌细胞非常敏感的标记物。BC1 在乳腺癌中失调，BC200是在具有不良预后的乳腺癌中过表达的RNA,因此可以被作为生物标志物。在肝癌(HULC) 中高度上调是肝癌特异性基因，其可以用作 HCC的生物标志物。当通过siRNA 敲低HULC时，5种基因的基因表达改变。其独特的表达模式和在组织样本的血液检测和 RT-PCR 中可以检测表达的事实使其成为HCC 生物标志物的良好选择。

神经退变性疾病

共济失调
LncRNA 已经与几种类型的脊髓小脑性共济失调(SCA) 有关联。 Daughters等发现SCA8 型(SCA8) 脑中lncRNA的功能获得突变。这些突变的特点是与肌肉盲样1(Mbnl1) 同处的CUG 扩展转录。他们还发现Mbln1 敲除小鼠表现出运动控制减低的SCA8 症状。在小鼠、人和人细胞培养物中，SCA8CUG扩增转录体也增加了GABT4( 一种CUGBP1-MBNL1 调节的中枢神经系统靶标)的表达，导致小脑颗粒细胞层中丧失GABA 抑制的能力。与CUG 扩增转录体相关的病理变化可以通过过度表达Mbnll 逆转，因为它在骨骼肌中过度表达有治疗作用。
阿尔茨海默病
阿尔茨海默病(AD) 在大多数老年人群中通过影响中枢神经系统引起痴呆。目前只有症状治疗。以治愈为导向的疗法是基于淀粉样蛋白级联理论，认为淀粉样蛋白β(Aβ)在脑中积累并诱导导致神经退变的通路。 Aβ 是淀粉样蛋白斑块的主要成分，是由β位点APP 切割酶1(BACE1) 切割的蛋白质片段和来自淀粉样蛋白前体蛋白(APP) 的γ-分泌酶。BACE1 作用是Aβ生成中的限速步骤，并且在AD患者中过表达，因此使BACE1成为靶向的明显选择。 BACE1 敲除的鼠似乎没有什么结果。设计的BACE1 抑制剂在动物模型中显示出希望，因为它们通过减少脑中的淀粉样蛋白斑块病理学来挽救认知缺陷。候选BACE1抑制剂药物在I 期临床试验中耐受性良好，并且在AD患者中进一步试验。最近已经发现，BACE1切割参与髓鞘形成、视网膜内环境稳定、脑电路和突触功能的某些底物，这可能指示在BACE1抑制剂可用作AD 患者的治疗之前必须解决的潜在不良反应107]。
Faghihi等表明BACE1由 lncRNA,BACE1-AS 调节。BACE1-AS 在 AD 脑

148 自闭症的异常基因调控：从转录到翻译

中过表达并且促进BACE1稳定性。增加的BACE1-AS的表达与Aβ 细胞应激子相关。BACE1-AS在淀粉样蛋白前体转基因小鼠和阿尔茨海默病患者中升高，表明该ncRNA可以驱动阿尔茨海默病的病理生理学108]。
由于AD 患者中 BACE1-AS 的水平升高，BACE1 通过前馈周期增加。 BACE1-AS掩盖miR-485-5p 结合位点。产生的BACE1 增加可能是由于缺乏抑制性miRNA,并且该miRNA有助于Aβ形成和淀粉样蛋白斑块形成。淀粉样斑块形成是一种慢性过程，并且持续很长时间。即使BACE1水平的微小变化也可能对AD的发病具有长期的影响。
Modarresi等也能够使用核酸锁siRNA 来敲低BACE1或 BACE1-AS,降低 Aβ 水平和促进寡聚Aβ 的积累。由于Aβ 参与神经发生，他们认为BACE1-AS 可以用作新的治疗靶标或用于早期检测AD的生物标志物!!J。

神经发育障碍

脆性X 染色体综合征
30%的脆性X 染色体综合征(FXS) 患者发生自闭症，FXS由脆性精神发育迟滞1基因FMRI 的5'非翻译区中的CGG 重复序列引起。发现FXS的治疗靶标可能有助于开发非FXS形式的自闭症的治疗。一个常常被忽略的 CGG重复的后果是在脆性X 患者中沉默IncRNA(FMR4) 。siRNA 敲低FMR4显著影响体外人类细胞增殖；基因敲低也增加细胞凋亡和改变细胞周期。 FMR4的过表达引起细胞增殖的增加。FMR4 似乎具有抗凋亡功能，并且显示可能有助于FXS表型的意想不到的功能复杂性[113。
唐氏综合征
lncRNANRON 抑制NFAT(活化T 细胞的核因子),一种在唐氏综合征中失调的转录因子(DS) 。当 NRON 耗尽时，T 细胞显示NFAT依赖性细胞因子的增加。证据似乎表明，IncRNA(NRON) 和蛋白质的复合物形成转录因子 (NFAT) 的支架和它调节的激酶，支持结合转录调节子的IncRNA具有支架功能的想法114]。
正常功能lncRNA XIST是触发X 染色体失活。 DS 是常见的染色体剂量障碍。IncRNA XIST 的基因表达，触发21号染色体抑制。它还逆转神经祖细胞和细胞增殖的缺陷，导致DS 患者大脑中的低细胞性。在除去XIST 和多西环素后，稳定地保持了异染色质沉默。XIST 靶向来自雌性DS 患者的非永生化成纤维细胞，导致在染色体21 上产生许多携带 XIST的细胞。由Jiang 等人

第9章针对非编码RNA 治疗自闭症谱系障碍 149

创建的XIST转基因缺少X 染色体“计数”序列，这与正常的雌性X 失活相容。这项工作揭示DS 可作为基因治疗的候选疾病，而XIST可作为候选的靶向治疗靶标基因人。在开发基因治疗之前，必须揭示基因功能以及功能校正。实验表明，染色体不平衡可以得到校正。X 染色体生物学和IncRNA 研究的进展为 DS的转化医学开辟新的途径115]。

用于临床试验的NcRNA

NeRNA是许多基因调节途径的一部分。当IncRNA由于遗传、表观遗传或环境因素而失调时，它们可能导致基因网络其他基因的失调，这些基因会导致发育改变。将难以改变这些有助于临床诊断的失调的翻译基因。然而，它们可以通过使用其调节性ncRNA 来操作。与这些翻译的致病基因互补的 neRNA 可以靶向这些过表达或低表达的基因。主要的挑战是将互补的ncRNA 转运到它们可以发挥效用的位置。使用ncRNA 作为治疗靶标，特别是lncRNA 是一个相对较新的研究领域，但是下一代RNA 测序正在快速开发，这将有助于鉴定相关的转录本[116。
几种类型的ncRNA已被用作抑制或上调基因牵连的疾病。 siRNA 和 RNAi是基因抑制的主要候选物，并且已经成功地抑制了其在几种疾病(包括前述的癌症)中的靶基因。除了siRNA 和 RNAi, 反义 RNA 和核酶(具有催化活性的RNA) 也是用于临床试验的候选物。
治疗剂的第一个实例是反义 RNA。反义RNA通常靶向mRNA,但它们也已经用于靶向miRNA。这些RNA 是与miRNA(antagomir) 反义的化学合成的寡核苷酸(ON), 并且可以抑制参与疾病的miRNA。锁定核酸(LNA)- 修饰 ON,称为miravirsen,抑制miR-122,一种参与丙型肝炎病毒(HCV) 感染的肝脏 miRNA。Miravirsen 已完成两个1期临床试验，是安全的。目前正在Ⅱa 期临床试验中测试HCV 患者的耐受性和疗效117]。22种不同的siRNA 疗法现已达到治疗16种疾病的临床试验
siRNA作为一种全身和局部给药已获得初步成功的药物。 siRNA 可以特异性敲低mRNA,并且容易设计和筛选。它的沉默效应也持续很长时间，并且可以在RISC中长期保持其催化能力。许多使用局部给药治疗视力丧失的 siRNA药物已经开始I 期临床试验119-1223,几种siRNA 和 shRNA用于局部给药治疗视力丧失和呼吸道病毒的疾病中目前处于0期和1期临床试验。
RNA适体是具有稳定的三维形状的单链核酸，其允许它们以高亲和力和特异性结合分子靶标。RNA 适体与靶抗体的亲和力和特异性相似，但它们也具有超过抗体的某些优点。由于适体在体外用 SELEX形成，它们更有

效、精确和经济地产生，这使得它们成为临床应用的更好选择。适体被化学修饰，因此它们可以靶向配体而不产生抗体存在的免疫应答。适体被修饰的能力是它们与抗体比较具备的另一个优点。适体可以连接到核酶以制备核糖开关或siRNA来制备适体-siRNA嵌合体。它们也小于抗体，其改善组织穿透和转运。已经临床测试了至少6种 RNA 适体。一种是 VEGF 特异性修饰的 RNA适体，用于治疗AMD,现在是FDA批准的药物。
核酶是可以进行与酶类似的生物化学作用的RNA分子。核酶已经进行临床测试作为基于治疗的方法使用CD4+T细胞或CD34+ 造血干细胞(HSC) 治疗艾滋病毒。CD34+HSC 分化成包括CD4+T 细胞的各种造血谱系。 ShRNA可以与核酶联合工作。使用基因修饰的自体免疫CD34+造血祖细胞 (HPCs) 为 HIV-1 开发了基于RNA的治疗，并且现在在美国的希望之城医院进行0期临床研究。基于RNA的治疗涉及三种RNA 组分，一个ShRNA, 一个反式激活响应(TAR) 诱饵和一个锤头核酶，所有这些都在慢病毒基因载体中编码。锤头核酶切割趋化因子受体5(CCR5)蛋白的mRNA₁34] 。CCR5 受体也是HIV-1 感染的共同受体，并且CD4+T 细胞的一个子集表达它。该受体对于正常T 细胞功能不是必需的，并且不易于突变逃逸，因此其可以是抗HIV治疗的良好靶标。

未来方向和结论

基于最近的遗传学发现，我们预计ncRNA将占ASD 风险的很大比例。我们自己的发表和未发表的数据表明lncRNA 是与ASD 最重要的遗传相关因素。在开发用于ASD 的反义治疗之前，需要在机制上建立这些IncRNA 对 ASD病因学的意义。已证明反义治疗对于其他常见病症(包括癌症和HIV) 是有效的。用于艾滋病和癌症的反义siRNA治疗在抑制成年人疾病的进展方面是有效的。应用反义siRNA治疗发展脑疾病构成了独特的挑战，包括医学的和社会的。医学挑战包括在正确的发育阶段对特定脑区域的反义治疗的定时和给药。社会挑战包括父母决定改变脑发育。然而，考虑到ASD对家庭和社会的负担，以及缺乏有效的治疗选择，我们建议设计一些能够用来理解潜在生物干预的实验是值得的。

本章要点

●最新的证据表明，lncRNA 可能导致很大部分ASD 病例
●长的非编码RNA(lncRNA) 在人类大脑中比蛋白质编码RNA 更丰富

第9章针对非编码RNA治疗自闭症谱系障碍 151

●一种以IncRNA 为靶向的新型药理学正在形成
● 靶向IncRNA 可能是ASD 的治疗选择
● 面临着医疗和社会挑战。

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第10章

自闭症中的 A-to-I RNA 编辑

Alal Eran,Isaac S.Kohane,Louis M.Kunkel 石寰译，丁岩孔学君校

摘要
通过破译自闭症谱系障碍(ASD) 的遗传基础所取得的重要进展，人们揭示了突触基因突变起决定性的作用。然而，遗传基因-环境的交互作用和对ASD表型相关机制的贡献至今很大程度上还存在不明确的地方。 RNA 正在成为一种在分子水平上解析应对中枢神经系统对环境因素应答的中心底物。 RNA 编辑技术是一种有效的能够随着环境改变调节基因功能和剂量的机制。最近，我们在患有自闭症个体死后大脑中发现突触基因A-to-I RNA 编辑会发生改变，这表明在ASD中表观遗传学机制可能发挥作用。在这里我们回顾一下我们目前对分子水平上的RNA编辑的理解，描述在动物模型中与出现的A-to-I RNA 编辑有关的行为表型，讨论近期发现的在人类身上A-to-I RNA 编辑以及推测在自闭症谱系障碍中关于A-to-I RNA编辑发生改变的相关诊断和预后潜力。
关键词：RNA 编辑；A-to-I; 自闭症；表观遗传学；遗传基因-环境的交互作用；神经发育；突触稳态。

简介

40年的家庭和双生子研究提供了大量的证据证明了自闭症谱系障碍是最具遗传性的复杂疾病之一。大量基因和基因座在自闭症患者中都被牵连在了一起，出现在小部分的家人中，导致疾病和其他基因组和环境要素相结合。
在各式各样、真实存在的自闭症谱系障碍中，其中一个功能节点便是许多

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基因和病因参与了突触形成和突触稳态,拷贝数目变异,常见变异,罕见的单核苷酸变异息息相关，在许多情况下都易患突触功能障碍。此外，它似乎存在稳态(“正常”)范围的突触功能和可能导致常见自闭症谱系障碍表型的两个极端偏差。例如，在动物模型中显示了被扩大和被缩小的突触蛋白合成都可以引发自闭症谱系障碍。同样，缺少某些 ASD 基因的老鼠显示其增加了兴奋性突触后电流，而缺少其他自闭症基因的老鼠会减少兴奋性突触后电流31-32]。因此，有人提出功能失调性神经稳态和改变的稳态补偿可能会导致灵活性减弱的神经元线路，最终共享ASD 表型这一观点。
突触和稳态两者都是在基因和环境的相互作用下形成的。虽然在确定ASD 易感基因方面取得了重大进展，但遗传基因-环境交互作用的相关机制没有很大程度的突破。比如，我们仍然不清楚在何种程度、在何种环境中的突变突触基因更易患ASD。此外，影响突触形成和动态平衡，以及能调节ASD 中受损基因的环境因素仍有待被发现。因此，仍然需要确定遗传基因-环境的相互作用以及观察突出功能障碍来确保在 ASD中准确地评估风险和有效干预。A-to-I RNA 编辑可能是一个能够连接环境刺激和突触传递的机制。我们最近报道了类似于上面描述的表型突触，A-to-I RNA 编辑也同样显示了在ASD患者中扩大和减小的两种模式。综上所述，理解 A-to-I RNA 编辑在ASD中的作用能够改善早期诊断，最终带领我们识别保证干预和预防的关键目标。

A-to-I RNA 编辑能够根据环境提示做出相应细微调整

A-to-IRNA 编辑是一种依赖性的转录修饰，通常根据环境的改变来调节基因功能和用量，这个过程大多数是在大脑中完成。作用于 RNA的腺苷酸脱氨酶(adenosinedeaminaseactingonRNA,ADAR)结合至双链 RNA 结构，催化带有精确的区域性和发育特异性的定点腺苷脱氨反应,编辑富集在可以调节突触传递的基因中，这些基因包括受体、离子通道和树突状微RNA 基因36,39,40]。在体外，我们看到编辑水平可以对神经元活动和神经调质剂做出动态回应。在体内，A-to-I RNA 编辑在神经发育过程中发生改变, 在特定的环境暴露和药物治疗中做出相应的反应51,52]。标准信号通路作用于进一步链接到A-to-I RNA 编辑和环境提示的编辑酶中： ADARB1需要肌醇发挥作用53,并且ADAR 表达是干扰素诱导的54]。为此，我们提出A-to-I RNA 编辑是构成链接环境暴露和神经生理学特性的分子机制之一的观点。

第10章自闭症中的A-to-I RNA 编辑    163

在分子水平上，肌苷与胞苷是一对碱基对，因此在细胞机械中也被称作为鸟苷。因此，A-to-I编辑的影响相当于从A 到 G 的突变，影响着部分转录本的动态变化。当A>G 的变化在编码区域出现的时候，它可能会重新编码蛋白质的氨基酸序列，直接改变蛋白质的功能。A>G 在剪接位点的变化可能会创造或者毁坏一个剪接位点。
虽然人类蛋白质的基因组编码少于1%,但在发展过程中大多数基因组编码会发生差异转录，因此我们认为它们具有功能属性65。因此，包括那些仍未被发现的编辑事件在内，大多数的编辑事件都有望直接影响到非编码RNA。尽管如此，我们大部分关于 A-to-I 的知识都来自典型的编码事件，其中RNA 编辑改变了编码蛋白质转录的氨基酸序列57-611。例如，G-蛋白偶联五羟色胺受体HTR2C在五个区域发生 A-to-I 编辑，这大大改变了G-蛋白偶联的活动，因此我们可以发现血清素水平与突触间的信号传递间的联系。这种编辑受学习、压力和服用抗抑郁药的慢性治疗的调节。另外一个例子是受神经发育调节的 AMPA受体GRIA2、GRIA3 和GRIA4 的编辑。额外的谷氨酰胺对精氨酸(Q,R) 的神经发育调控的编码在红藻氨酸受体GRIK1 和GRIK2跨膜域中会降低其钙渗透率【58】。从0到100%的mRNA分子可以在任意给定的点编辑。Q/R和 R/G离子型谷氨酸受体的编辑为根据环境的改变做出微调的谷氨酸能神经元突触提供了一种有效的手段(图10-1)。

GRIK1             GRIK2                      GRIA2                      GRIA3             GRIA4

Q1B中性谷氨酰胺到正三价精氨酸减少钙离子的通透性

RMC 精氨酸到甘氨酸导致更快的脱敏恢复

图10-1离子型谷氨酸受体，受A-to-IRNA 重新编码调节。三个AMPA受体和两个红藻氨酸谷氨酸受体受A-to-IRNA的编辑。 GRIK1 、GRIK2和 GRIA2 的跨膜域的Q/R 编辑极大地改变了其钙渗透。因此，树突状RNA 颗粒的A-to-I 编辑能够提供一种效率极高的办法来对环境线索的变化快速微调突触强度和持续时间，为突触可塑性作出了贡献

164                自闭症的异常基因调控：从转录到翻译

A-to-IRNA 编辑能够在生物体模型中调节复杂行为

直到最近人们才开始理解 A-to-I 编辑对动物行为的影响。极端的表型与传统敲除的编辑的酶有关。这其中包括癫痫发作、早期病死率和缺乏基本的运动技能等。在果蝇的研究中我们发现整体果蝇编辑水平工程导致了异常的昼夜节律、雄性求偶和交配行为。在一个社会互动小鼠测试中，五羟色胺受体Htr2c 的工程编辑水平导致侵略性冲动行为的增加68,在高架十字迷宫中的焦虑行为。这些行为与小鼠模型中观察到的自闭症基因相似31,80]。此外，在常见的ASD(15q11-13重复)中染色体改变的小鼠模型中显示 HTR2C 编辑的改变与自闭症患者的行为息息相关81]。扰乱小鼠的整体编辑水平导致了野外养育方式的增加，也导致了包括听力能力下降的运动缺陷70]。相反，经历过标准学习范式的老鼠导致了编辑水平的变化。

基因组学技术革命使快速发现人类的A-to-IRNA 编辑成为可能

与其他动物相比(包括灵长类动物),我们已经提出了在人类中增加编辑来生成分子的复杂性以备更高层次的人类认知的需要36,83,84,85]。然而，尽管 A-to-I RNA 编辑扮演着非常重要的角色，但我们仍对其所知甚少。基因组学技术革命最近第一次在不同的人体组织和条件当中进行了大规模的编辑调查。

在自闭症儿童死后大脑中检测到的A-to-I RNA 编辑

以下几条证据能够检验自闭症谱系障碍人中A-to-I 编辑。首先，具有改

第10章自闭症中的A-to-I RNA 编辑 165

变 A-to-I 编辑的模型生物体显示患有自闭症谱系障碍的人能够适应不良行
为。第二，在患有自闭症的小鼠模型中。第三，最常见的导致ASD⁹9 的单基因—— 脆性X 综合征果蝇模型，通过脆弱X 基因dFMR1和编辑酶dADAR1001之间的直接交互作用最近显示出非常显著的编辑变化。最后，独立的基因组研究涉及突触基因变体401,这是最具有编辑类型的变体，也是ASD患者反复出现的主题。
对于ASD中 A-to-I RNA编辑的初步检查，我们最近配置的神经发育调节编辑的25个死后小脑的ASD和匹配的神经典型对照组儿童的突触基因。使用RNA的超深测序和DNA的匹配基因分型，我们在cDNA上检测到A/G 混合物，其映射到纯合基因组A/A, 指示A-to-I RNA编辑。通过成像和尸体解剖研究，在尸检后小脑中测量编辑，所述小脑是涉及ASD 的几个脑区域之二[101。这种方法产生了来自个体的突触A-to-RNA 编辑的高置信度数据集与 ASD和匹配的对照组。
出乎意料地发现编辑水平的广泛分布跨越仔细匹配的ASD个体和神经典型对照组中所有以前显示为小鼠神经发育调节的位点。ASD个体在25个检查的位点中有20个位点表现出极端编辑谱(图10-2)。具有极高的突触编辑水平提示高度的ASD 信号，阳性预测值为78%(即，P(ASDIIZ 编辑l>2)=
0.78)。在不同地点的离群值代表ASD 的不同个体，超过3个平均值标准偏差的编辑是ASD的个体特有的。ASD总体编辑差异是典型性神经病个体的2 倍多(Brown-Forsythe P=0.005)
图10-2中所示的大多数重新编码位点主要是由 ADARB1 编辑。为了探讨观察到的编辑差异调节的基础，研究人员对在同一队列中ADARBI 表达和相对同源异构体的使用进行了检测。在人类中，来自含有两个双链RNA 结合结构域(dsRBD) 的外显子替代跳过而产生的功能失调性ADARBI 同源异构体 (ADAR2g,NR_027672), 被发现构成约20%的成年小脑ADARB1 mRNA。这样，通过定量和半定量RT-PCR 测定了编码dsRBDs外显子的存在。而ASD个体与正常对照个体ADARBI 的总体表达水平类似，非活动ADARB1同源异构体的相对使用在 ASD 个体中显著升高[图10-3,P=0.005,Kolmogorov- Smirnov(KS) 试验]。通过所有位点编辑Z 分数的总和来衡量，功能障碍同源异构体的相对频率与总体编辑水平相关(Pearson's       P=0.03)。值得注意的是，最近显示ADARB1是视黄酸相关的孤儿受体α(RORA) 的直接靶标和血液

166    自闭症的异常基因调控：从转录到翻译

-5 -4 -3 -2 -10
GRIA2Q/RGRIK2 Q/R GRIK2 Y/C GYFIP2 K/E GRIA2 R/G GRIA4 R/G GABRA3I/M
HTR2CAGRIK1 Q/R FLNA Q/R GRIK2 I/V
HTR2C D GRIA3 R/G
HTR2C C GRIA2 Q/R+4
HTR2C B
KCNA I/V
HTR2CE GRIA4 R/G-1
GRIA3R/G-1 GRIK2 Q/R-17
GRIA2 R/G-1 CYFIP2 K/E+1 GRIK1 Q/R-17
GRIK2 Q/R-4

1    2 3    4    5

ASD
正常对照

图10-2突触编辑在 ASD 个人(黑色)和典型性神经病个体(灰色)的差异。显示的是与所有位点的平均编辑水平(Z 分数)个体标准化偏差，证明了人口编辑分布的极点往往是ASD个体。水平线表示个体后验编辑分布的标准化95%置信区间。上面是所有单独的Z 分数的汇总分布，显示极端编辑特定于ASD的个体。处于
极限值P(ASDIIZI>2) 的阳性预测值为0.78

中减少。

未来方向

最近的发现支持A-to-I RNA 编辑在ASD病因中的作用，但也提出了几个关键问题和提供了令人兴奋的对未来新发现的机会。首先，在ASD中的全基因组编辑模式仍然需要确定并与典型的发育儿童进行比较。需要检查更多的个体和更多的脑区域以完全理解在我们的初始研究中检测到的编辑改变的范

第10章自闭症中的A-to-IRNA 编辑    167

ASD             正常对照
图10-3 在具有ASD 和正常对照个体之间 ADARB1 无活性形式的相对使用的差异(P=0.005,KS 试验)。这种同源异构体缺乏酶的双链 RNA 结合结构域并且是非翻译的。
ADARB1是图10-2所示位点的主要编辑酶

围和规模。高质量的ASD 个体死后脑组织的可用性增加1073和正在进行的大规模人脑测序项目108,109应该能对够跨越群体、个体、脑区域、细胞类型和ASD 的特异性分子病因的A-to-I 编辑进行系统检查。
第二，虽然A-to-I 编辑是一个以脑为中心的现象，它可能在外周血中留下痕迹，如果检测到的话，可能为外周血ASD 早期诊断提供丰富的信息。最近的研究表明，外周血RNA 可能提供了解 ASD中的神经系统的改变信息，在单基因和通路水平的重现性差异表达106,10-112],和基于血液表达的临床试验的诊断测试113]。未来的工作应该检查在血液中检测RNA 编辑的潜在诊断应用。要克服的一个关键挑战是，由于RNA 的动态范围，传统的RNAseq 不能精确定量外源血液中罕见转录体的编辑水平。因此，应该对于血液编辑型采用定制的编辑检测方法，例如新开发的基于多重 PCR 微流体和深度测序(mmPCR-Seq¹4)。
最终的长期未来方向是基于ASD 的个体化细胞模型的预期创建。尽管患者衍生的诱导多能干细胞(iPSC) 的定向分化仍然是一个挑战，在可预见的未来，我们预期标准化生产 iPSC 衍生的神经元，到那时，ASD 个体的基因组倾向、A-to-I RNA 编辑、特定环境刺激、突触发生和电生理体内稳态之间的关系即可首次得到研究。这样的细胞系统还能够对受影响的神经元维持复杂内稳态的潜在干预的影响进行个体化离体测试，最终有利于选择较好的ASD 治疗
方案。

168          自闭症的异常基因调控：从转录到翻译

本章要点

●腺苷-肌苷(A-to-I)RNA 编辑改变神经元转录体的序列来响应环境刺激，微调基因功能和剂量。
●突触功能，ASD 中的主要新兴病因，通过A-to-I RNA编辑，体外和体内被有效调节。
●遗传工程改变的 A-t1o-I编辑水平的动物的行为概括了人类ASD 的几个方面。
● 脆性X 智力迟钝蛋白(FMRP)可直接与编辑设施结合，其功能的丧失是 ASD最常见的病因。没有FMRP 的果蝇表现出显著的编辑改变。
●基因组学技术革命能够在典型的发育和疾病中快速发现人类RNA 的编辑。已在胶质母细胞瘤、精神分裂症和ASD 中检测到了可变编辑。
● 来自ASD 个体的尸检大脑匹配的正常个体对照相比，一直显示候选突触基因的极端编辑水平，提示A-to-I编辑可能在ASD中起作用。
●编码酶ADARB1的非活性形式在自闭性小脑中更常见，并且其相对丰度与整体编辑水平相关。
●未来对外周血和患者来源的编辑调查 ASD 的细胞模型将揭示 A-to-I编辑水平的诊断和预后信息内容。

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第11章

自闭症和脆性 X 综合征的翻译控制

Christos G.Gkogkas,Argel Aguilar-Valles,
Arkady Khoutorsky,Nahum Sonenberg 石寰译，丁岩孔学君校

摘要
mRNA 翻译的控制是神经元响应脑生理学中经验依赖性变化的关键特征。翻译的失调已经与具有神经发育起源的几种精神性脑病症的病因学有关，例如自闭症谱系障碍(ASD) 。在这里，我们综合评论了ASD和单基因疾病如脆性X 综合征(FXS) 翻译失调的证据。此外，我们总结了在这些疾病中控制mRNA 翻译的神经元信号转导通路的治疗进展。以ASD 和 FXS中的信号通路的改变为鉴定这些病症中的治疗措施提供了广阔的研究空间。
关键词：自闭症谱系障碍；脆性X 综合征；翻译；翻译控制。

前言

mRNA翻译
mRNA 翻译(也称为蛋白质合成)是一种复杂的多步过程，其在时间上分为三个步骤：起始，延伸和终止，如下所述1。
起始
在真核生物中，起始由一系列步骤组成，引发80S 核糖体在mRNA 上起始密码子(AUG) 处组装。翻译起始由eIF 介导(真核起始因子)。在起始的第一步中，eIF2 与 GTP和携带甲硫氨酸的转运RNA(三元复合物)结合，通过其他 eIFS(如eIF1,eIF1A 和eIF3) 辅助将后者递送至40S 核糖体。40S 核糖体与三元复合物组合形成43S 前起始复合物(PIC) 。然后通过eIF4F(由RNA解旋酶

178 自闭症的异常基因调控：从转录到翻译

eIF4A, 帽结合eIF4E 和脚手架eIF4G 形成的复合物),eIF4B 和 PABP的协同作用，将43S PIC 募集到所有真核核转录的mRNA中的 5′端帽结构。最后，43S PIC 扫描mRNA 直到它到达起始密码子，其中elF2 结合的GTP 被水解，随后是连接60S 核糖体亚基以形成80S 起始复合物。
延伸
延伸由通过以下延伸因子促进的重复循环构成：①氨酰基-tRNA 选择和转移至核糖体的A 位点；②肽键形成；③易位。当更多的氨酰-tRNA结合到A 位点时，核糖体持续翻译mRNA 上的密码子，直到核糖体到达mRNA 上的终止密码子。
终止
识别终止密码子，与释放因子一致，引起核糖体的去稳定化和聚解，以及多肽链的释放。
翻译控制
翻译过程是被高度调节的，大多数调节是作用在启动的水平。翻译控制是在转录活性低(例如早期发育)的条件下以及在翻译受到空间控制的细胞(例如神经元)中以快速方式改变蛋白质量的有效方式³。由于神经元中局部树突状翻译的关键作用，翻译控制的后一方面对于神经元生理学特别重要4。翻译起始的控制通过几种信号通路实现，包括雷帕霉素(TOR) 的哺乳动物/机械靶标，丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)/ 细胞外信号调节激酶(ERK) 和 eIF2α 磷酸化。
mTOR途径
mTOR 是一种丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶，其作为主要传感器整合细胞外信息输入如胰岛素，生长因子和营养物以及细胞内氧含量，能量水平和氨基酸水平，影响包括细胞生长、增殖和自噬在内的结果5。在神经元中，mTOR 整合突触可塑性相关输入和神经元活动，谷氨酸下游[例如N-甲基-D-天冬氨酸受体(NMDA) 和 I 型代谢型谷氨酸受体(mGluR)], 多巴胺[多巴胺D1/5],神经营养因子[酪氨酸激酶受体B(TrkB)]和胰岛素受体[例如，胰岛素样生长因子(IGF-1)] 。mTOR被雷帕霉素，一种具有强效免疫抑制和抗增殖性质的抗真菌药物阻断。mTOR 是两种不同复合物的催化亚基：mTORC1和 mTORC2。 mTORC1 活性被急性雷帕霉素治疗抑制，而mTORC2 活性仅对慢性雷帕霉素治疗敏感。

第11章自闭症和脆性X 综合征的翻译控制 179
在mTORC1的上游，结节性硬化复合物蛋白(TSC1 和 TSC2)是抑制激活 mTOR的 G 蛋白Rheb(富含脑的Ras 同源物)的GTP酶激活蛋白。TSC2 在磷酸化时失活，这减轻Rheb 抑制以激活mTORC1。PTEN(磷酸酶和张力蛋白同源物)是mTORC1途径的抑制剂，通过磷酸化磷脂酰肌醇(3,4,5)-三磷酸5。
描述得最清楚的eIF4F 调节机制是由3个小分子量蛋白质家族的成员即 eE4E 结合蛋白(4E-BPs:4E-BP1,4E-BP2和 4E-BP3) 完成的 6 。eIF4E 是 eIF4F的组件，其直接结合待翻译的mRNA的5'-末端帽结构。4E-BPS通过抑制eIF4F 复合体的装配特异性抑制帽依赖性翻译起始，随后将核糖体募集至mRNA⁶,7】。4E-BP和 eIF4G 共享一个共同的eIF4E 结合位点，通过它们竞争结合eIF4E8的凸面背面8。非磷酸化的4E-BP以高亲和力结合eIF4E, 但是在mTORC1磷酸化后，它们从eIF4E 游离，导致翻译起始刺激⁹。
mTORC1还磷酸化40S 核糖体蛋白S6 激酶(S6K:S6K1 和 S6K2), 其依次磷酸化翻译起始因子eIF4B 和核糖体蛋白S6 以促进翻译。S6K1 还通过磷酸化其激酶(eEF2K) 来靶向延长因子2(eEF2)10] 。mTORC1被认为通过抑制蛋白磷酸酶2A(PP2A) 的磷酸酶活性来调节其下游靶的磷酸化1。

Ras/MEK/Erk/Mnk

MAPK/ERK 途径刺激蛋白质合成。活化的MAPK ERK 磷酸化，从而激活 MAP 激酶相互作用激酶1和2(Mnk1,2) 。Mnks结合eIF4G 并磷酸化eIF4E 对Ser209¹2 。eIF4E的磷酸化促进cap-dependent的翻译[1。

elF2α

eIF2 的α亚基的Ser51的磷酸化将eIF2 转化为一个主要的eIF2B GEF 活性抑制剂并降低一般翻译。然而，mRNA的子集(其在其5'UTR 中含有上游开放阅读框(uORF),例如ATF4 mRNA)的翻译被反常刺激。相比之下，eIF2α 的去磷酸化增加一般翻译和减少ATF4 mRNA 翻译 1 。ATF4是转录因子cAMP 反应元件结合蛋白(CREB) 介导的基因表达的抑制剂，这是突触可塑性和记忆的长期变化所必需的4。
神经停滞的多核糖体
最近的工作提供了数据，树突状mRNA 的重要部分存在于停滞的多核糖体上，其在这种状态下被运输到突触后位点。这种翻译模式绕过限速起始步骤并允许突触mRNA 快速翻译成突触信号。

自闭症谱系障碍(ASD)

根据世界卫生组织的数据显示，由于神经精神疾病导致的全球疾病负担总量的比例预计从目前的11%上升到2020年的14.7%。尽管神经精神障碍普遍存在，但在理解病理生理和有效治疗上发展缓慢。因此，对神经精神疾病，如精神分裂症、情感障碍(抑郁症和双相情感障碍)和自闭症谱系障碍 (ASD) 病因的了解是势在必行的。尽管在临床前期实验和临床方法上有很大的进步，对神经发育障碍的了解和治疗对生物医学来说还是面临许多挑战。
ASD

3岁以前的语言、社交互动和行为灵活性障碍构成了定义自闭症症状的三元素。临床表现为高度异质性，患者的症状严重程度差异很大。通过多重平行和互补的方法(图11-1)帮助 ASD 遗传风险因素的识别。母系遗传重复的染色体，连同其他罕见染色体异常是重要的原因。通过重测序或基于芯片的方法鉴定了具有主要影响的新的个体基因(例如，NLGN4,NRXN1和 SHANK3)。ASD 连锁研究一直存在争议，因为连锁峰在全基因组水平上很少有显著性并且难以在研究中复制。几个大的 ASD GWAS已经鉴定了 SNP, 其在全基因组水平与ASD显著相关。此外，研究证明在ASD中罕见的新生 CNV 的发病率更高,并且已鉴定出6种ASD基因：CHD8,DYRK1A,GRIN2B,KATNAL2,POGZ和 SCN2A,其携带复发的、高度损伤的新生突变16。最后，与对照相比，在ASD病例中发现了新的致病性SNV(单核苷酸变体)。
E/I 平衡
在精神分裂症和ASD的患者和动物模型中明显地观察到对兴奋性/抑制性(E/I) 突触传递比的不平衡。具有ASD的儿童表现出静止状态神经元活动的升高，与E/I不平衡作为神经生物学特征一致25]。使用光遗传学的E/I 平衡的调节直接影响成年小鼠中的自闭症样行为。几种ASD小鼠模型显示 E/I 由于改变的谷氨酸能激发或改变的GABA(γ- 氨基丁酸)能力的抑制而失衡，导致分别增或降E/I比。然而，控制E/I平衡的分子机制尚未被很好地理解。
脆性X 综合征(FXS)

FXS 的遗传学
脆性X 综合征(FXS) 是最常见的遗传性智力残疾(ID) 和最常见的已知单

第11章自闭症和脆性X 综合征的翻译控制 181

198019851990199520002005 现在细胞遗传学分析
识别在特定遗传疾病中升高的ASD风险
细化诊断ASD(ADOs,ADI-R)
关联研究(候选基因)
全基因组关联研究
重排序(候选基因)
CNV分析(检测和表征)
全基因组关联研究
重新测序(通过下拉或全基因组的整个外显子组)
图11-1自闭症谱系遗传学的研究已经加速，主要是由于方法的变化。通过国际合作的大型队列，结合基于芯片和测序的技术允许检测全基因组的基因变异。将需要大量的计算基础设施来解释这些结果。 ADOS 表示自闭症诊断观察量表；
ADI-R, 自闭症诊断面试-修订版；CNV, 拷贝数变异；SNP, 单核苷酸多态性。改编自参考文献116
基因造成的ASD32,33]。FXS首先在显示具有X 连锁的ID 家系中被提到34, 其名称源于显示在X 染色体的长臂上Xq27.3 位置处的特征性收缩区域或脆弱位点的细胞遗传测定35]。 FXS 突变是脆弱 X 智力迟滞的5'非翻译区 (UTR) 中的三核苷酸重复的扩展1基因(FMR1)36] 。在一般人群中，扩展发生的正常范围是40～50个CGG重复；当膨胀为大约55至200次重复时考虑前置状态。当这些 CpG岛产生甲基化时，FXS 的完全突变由大于200个CGG 重复的扩展组成，阻止了FMR1的转录37-39]。只有完全突变能导致基因的表达抑制，继而发生FXS。
FMRP在 FXS中的因果作用已经通过研究证实，证明在FXS和具有 FXS样症状的个体中也发现影响FMRP功能或表达的其他突变。突变前状态可以反过来导致脆性X 相关的在女性携带者。最近，表明非扩张(CGG)30-50和在FMR1 基因内突变前状态的160个重复，进行重复相关的非AUG(RAN) 翻译。其中在不存在起始AUG 或同源AUG 密码子的情况下，从扩增的(CAG)N 重复的所有阅读框内开始。这些多肽易于聚集，并且被认为是在FXTAS中观察到的包涵体，其有助于了解疾病发病机制47]。然而，尚不清楚突变前状态受mRNA诱导的毒性还是FMRP的量减少影响的程度47J。
FXS 的临床表型

具有脆性-X 完全突变和FXS 的个体显示出典型的身体特征和相关的医学问题(即，大睾丸、大头畸形、高拱形腭、过度伸展的关节、皮肤软、复发性中

182    自闭症的异常基因调控：从转录到翻译

耳炎和鼻窦炎、胃食管反流、斜视和远视、贪食、肥胖、二尖瓣脱垂和瓣膜功能不全、睡眠模式紊乱和阻塞性睡眠呼吸暂停),以及智障及多种行为问题。男性中的综合征比女性更严重，因为杂合雌性从正常的X 染色体表达FMRP, 其量取决于X 失活的程度。具有FXS 的男性具有行为异常，包括多动、冲动、注意力问题，具有恐怖症和焦虑的多个特定领域的广泛性焦虑，情绪不稳定性和自闭症特征，例如对视不良、羞怯、自言自语、手抖动、咬手、感觉超敏、明显的语言及行为障碍32]。这些问题只有一部分在女性中是常见的，包括注意力问题、冲动、害羞、选择性失语、特异性恐惧、社交焦虑和社交障碍。
自闭症行为模式在患有FXS 的男孩中非常常见(50%～90%),特别是回避和焦虑行为，并且约18%～36%满足 ASD的全部标准。尽管与ASD重叠，FXS的社会行为模式通常不同于典型的自闭症：FXS 的个体具有强烈的社交兴趣，但是具有高水平的社交焦虑。约15%的男性和6%～8%的女性 FXS 发生癫痫，并且似乎是增加自闭症风险的指标。
ASD 翻译控制的失调

ASD 和翻译

几种具有mTOR 上游突变的单基因疾病，具有自闭症高发率，其特征在于突触蛋白质的翻译水平和连接性增加(表11- 1)。这些疾病包括 FXS( 由FMRP 水平降低引起)491;结节性硬化症综合征，其中85%受影响的患者表现出与自闭症特征、癫痫和异常或缺乏语言紧密相关的认知障碍;PTEN 错构瘤综合征 ASD伴有大脑畸形的患者显示类似自闭症和语言障碍的特征51]。相反，在Rett 综合征中，MeCP2(甲基CpG 结合蛋白2)的丧失功能突变导致突触蛋白的可用性降低和低连通性。
首先建议 eIF4E 和自闭症之间的链接是基于4q 和 5q 之间的新生染色体易位定位到经典自闭症男孩的eIF4E 基因⁵2]。另外，在两个不相关的家庭中，两个自闭的兄弟姐妹和父母中的一方在eIF4E 启动子的基础元素中在位置-25处具有相同的单核苷酸插入52]。这种突变导致eIF4EmRNA 水平增加和可能更多的蛋白质。最近报道了一个作为高度互连的与散发性自闭症相关的蛋白质网络的组成部分的eIF4G 新生突变53]。这些数据表明，失调的eIF4F 复合物形成可能与某些形式的 ASD 相关。有趣的是，一对Rett 综合征的姐妹，拥有相同的MeCP2 突变和类似水平的X 染色体失活[一个人不能说话或走路，有一个明显的智力缺陷(经典Rett 综合征),而另一个人可以说话和走路，并具有中度智力残疾(Zappella变体)]。外显子测序检测到了Rett 综合征患者中的PABPC1 突变，但在Zappella 变体中没有检测到。

1-1自闭症高发的

基因紊乱发生自闭症的概率在自闭症中的发生率

MR
基因功能
FMR1脆性X综合征 15%～30% 2%～5% + 翻译抑制子
TSC1/2结节性硬化综合征 25%～60% 1%~4% + mTOR抑制剂
PTENPTEN错构瘤综合征(ASD与大头畸形) ND 1% + P13sK/mTOR信号抑制剂
NF11型神经纤维瘤病 4% 0~4% + Ras Gap
MECP 2 雷特综合征 100% 2% + 全球转录阻遏物
UBE3A 天使综合征 40% 1% 十 E3泛素连接酶
CACNA1C 蒂莫西氏综合征 60% <1% + L型电压门控钙通道(Cav1.2)
NLGN3/4 家族性ASD ND <1% 十突触粘连
NRXN1 家族性ASD ND <1% + 突触粘连
SHANK3 家族性ASD(22ql3微缺失综合征) ND <1% + PSD脚手架

PTEN 或 TSC2 在小鼠中的单倍不足导致大脑尺寸的增加。这让人想起在ASD 儿童中的大型脑病的高发病率。类似地，TSC2 +/-小鼠显示记忆缺欠55和神经元胞体和树突棘的增大58]。雷帕霉素预防和逆转神经元肥大，改善一部分PTEN 相关的异常行为[⁵9]。用雷帕霉素对成熟 TSC2+/- 小鼠的短暂治疗不仅改善突触可塑性缺陷，而且能改善行为缺陷。最近，两项研究证明eIF4E 依赖性翻译在小鼠ASD 样行为的发展和逆转中的作用60,61]。遗传删除4E-BP2 可诱导神经连结蛋白(neuroligins)的过度翻译，导致E/I比率的不平衡，这与社会互动、重复行为和交流障碍有关60]。类似地，eIF4E 的过表达可以诱导由于过度的蛋白质合成和E/I的不平衡而产生的自闭症样行为。这些突触和行为表型可以通过抑制 eIF4F 活性(使用4EGI-1, 一种eIF4E-eIF4G 相互作用抑制剂)或减少神经连结蛋白1的表达获得逆转。
FXS 翻译控制的失调

FMRP是一种mRNA 结合蛋白³7,并被认为在神经元中的活性依赖性mRNA代谢的几个方面发挥作用，包括转运、稳定性和翻译的调节。FMRP 含有3个与特异性RNA 靶标相互作用的RNA 结合基序元素：2个hnRNP K-同源(KH) 结构域和RGG box。KH结构域被认为与RNA 中的“接吻复合” 三级基序结合63,而 RGG box 可能以甲基化-依赖的方式识别茎-G 四联环[64。
目前认为FMRP 在转运mRNA 中起作用，因为此蛋白质定位于从胞体到树突和轴突的通行的信使核糖核蛋白(mRNP) 复合物中62]。已经在所有类型的 RNA 颗粒中发现了FMRP mRNP( 即P 体，应力颗粒和高密度颗粒),并被认为是翻译抑制的mRNPs⁶21 。然而，FMRP 对于其大部分靶标mRNA在树突中的定位似乎不是必需的。
FMRP抑制蛋白合成，但产生抑制的机制仍有争议621。 FMRP 可以通过阻断延伸来抑制翻译，这与其结合到停止核糖体上的 mRNA 编码序列一致[⁶5]。其他研究报道了它在控制启动中的作用，因为FMRP 与单体80S 核糖体共沉淀并在轻的mRNP 与 BC1(脑细胞质RNA1),CYFIP1 (细胞质FMRP 相互作用蛋白)和翻译起始因子的复合物中62]。这些模型之间的差异也有详细讨论。
mGluR 理论

FXS[32,62,70的神经病理生理学基础已通过FMR1KO 小鼠得到了进一步认

第11章自闭症和脆性X 综合征的翻译控制 185
识，显示基础蛋白质合成的增加7¹,癫痫发作易感性，以及树突和行为的改变都和FXS患者有关。其中一个特定方面已经证明对于治疗的开发是非常有希望的。代谢型谷氨酸受体1/5(mGluR1/5)介导的长期抑郁(LTD),海马突触可塑性的特定蛋白合成依赖形式的显著增加,及FMR1 KO小鼠独立的蛋白质合成。这与FMRP 是突触蛋白合成的抑制剂的想法一致77]。这导致了FXS的 mGluR理论的形成，其假定失调的mGluR1/5 介导的蛋白质合成依赖形式的突触可塑性参与了 FXS 的病理学(图11-2)。因此， mGluR1/5 信号传导被认为是FXS 的有希望的治疗靶标。其他mGluR1/5 依赖的神经元机制也在FXS的小鼠模型的脑中失调。在海马中，mGluR1/5 参与延长癫痫样放电，增加内源性大麻素合成和释放以及在某些形式的LTP 中发现的改变32]。FMR1 KO小鼠表现出mGlu1/5 信号传导和在突出的皮层，杏仁核和小脑的突触可塑性的改变。
小鼠79.801和果蝇8 模型的研究为mGluR 理论提供了强有力的支持。通过产生 FMRI-/y mGLuR5+/-小鼠，在小鼠中的遗传逆转证明可以校正升高的海马蛋白合成，刺激诱导的癫痫发作，夸张的LTD,增加的树突棘密度和过度的记忆丧失。mGluR5的药理学拮抗作用证明改善由于不存在FMRP 所导致的改变。2-甲基-6-(苯基乙炔基)-吡啶(MPEP),mGluR5 负性变构调节剂减少多糖和RNA颗粒中恶化的蛋白质合成和改变。这些研究提供了令人信服的证据，改变mGluR5依赖蛋白质合成直接影响在FXS 中观察到的认知和行为表型的突触变化。
FMRP和转录的信号传导
FMRP的缺乏或下调影响几百个mRNA,使 FXS的药物开发复杂化。然而，FMRP表型可以通过靶向干预在FXS 中失调的可激活mRNA 翻译起始的两个信号通路来实现逆转。一方面，来自FXS 受影响的个体的淋巴细胞的ERK 活化被延迟86],另一方面，FXS死后的脑组织显示增强的ERK 信号。因此，在FmrlKO小鼠中，ERK1/2 的抑制能够校正增加的基础蛋白合成并减少声音引起的抽搐。在这方面，在FXS 的小鼠模型中88观察到增加的 eIF4E 磷酸化(其是ERK 途径的下游靶标),并且在FXS 患者中获得确认89]。同时，磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K),mTORC1激活的上游，在FMRP 表达缺失的突触下异常活化，这导致加剧的基础蛋白合成和激动剂诱导的蛋白质合成的阻塞[90,911。因为ERK 和 PI3K 信号传导途径可以被几种神经递质受体激活( 如mGluR1/5(图11-2),毒蕈碱乙酰胆碱受体，多巴胺D1/5受体和TrkB), 它们的靶向有望用于校正FXS。
靶向参与其他参与翻译控制的因子也能够使FXS 相关表型得到逆转。在

186             自闭症的异常基因调控：从转录到翻译

图 11-2 在 mRNA 翻译的控制中被mGluR1/5 激活的信号通路在FXS 中是功能失调。mGluR1/5 是 G-蛋白偶联受体，其激活参与mRNA 翻译控制的两种信号通路。PI3K/mTORC1 途径涉及TSC1/2 和 PTEN的失活，通过4E-BP 和 S6K 的磷酸化来控制翻译。同时，MAPK/ERK 导致eIF4E 的磷酸化，也与活动性翻译相关。
FMRP与阻滞的 mRNA相关，并且这种抑制可以通过mGluR5 的活化来缓解。
FMRP的缺席导致基线翻译的提高和mGluR5 下游脑生理学的改变，包括海马 LTD 加剧。这一发现导致了mGluR5 的 FXS 理论形成和现在在临床试验中 mGlur5 拮抗剂的开发

FMR1 KO小鼠中S6K1的遗传减少逆转FXS样表型92]。另外，洛伐他汀(一种降血脂药)通过间接靶向ERK 通路而逆转 FMR1KO 小鼠中的自闭症样表型。类似地，细胞质多聚腺苷酸化元素结合蛋白1(CPEB1) 的遗传删除也使得FMR1KO小鼠的几个行为和突触缺陷获得逆转⁹4。
FXS 和某些形式的ASD 之间的分子重叠是基于在没有FMRP 的情况下与自闭症相关的基因的调节异常。在这方面，一些直接由FMRP 控制mRNA 翻译的蛋白质，包括 neuroligins,neurexin1,PTEN,PSD95,MAPK1 和 SHANK333 也与自闭症有关。

未来方向

翻译是一个“可用药治疗的”过程

现在我们对翻译的控制的机制有了更清楚的了解。这导致了几种新的化

第11章自闭症和脆性X 综合征的翻译控制 187

合物的合成，主要开发用于癌症治疗，其中一些用于临床试验的后期95。因此，目前存在直接或间接翻译抑制剂，其功能如下：①靶向调节eIF4F 复合体装配(雷帕霉素类似物或 Rapalogs);② 抑制靶向mTOR 的激酶；③采用双特异性 PI3K/mTOR 抑制剂；④直接靶向 eIF4F:(a) 与 m⁷GpppN帽结构结合的 elEE竞争，(b)解开eIF4E-eIF4G相互作用的偶联，(c) 靶向 eIF4E的合成， (d)阻断eIF4A 的活性，以及(e)抑制eIF4E 磷酸化；⑤阻断三元复合物形成。
FXS 和 ASD的临床试验
关于对ASD 的测试药物的关键问题是何时开始治疗和维持多长时间。在诸如 ASD幼年发病的疾病中，在儿童中进行测试药物是一个艰巨而且困难的任务。特别彻底和严格的临床前测试，必须先从成年人开始，随后逐渐过渡到年轻的患者。对于FXS 的病例，一个非常乐观的策略是识别和靶向与其表型不成比例的信息途径，例如 I型的mGluRs78],PI3K70]和 ERK,即控制 mRNA的翻译。
用于逆转FXS 表型研究最多的靶点是mGluR5,目前人们正在考虑将许多第 I 组 mGluR 的拮抗剂用于FXS 和自闭症的治疗上。对 FXS 的早期临床试验显示了对fenobam 的开放标记试验令人鼓舞的结果97]。在该研究中，给12 名成年男性和女性患者单次口服剂量，结果显示他们的一般焦虑水平和前脉冲抑制得以提高，而且没有安全性问题。同时，基于在小鼠模型中的乐观结果98],进行了使用Novartis 化合物AFQ056的随机双盲试验。该研究报告了具有FMR1 等位基因完全甲基化的FXS 个体，他们的不协调动作行为、多动和言语障碍都得到改善，而只有部分FMR1基因甲基化的个体在行为上没有显示统计学显著的变化⁹91。该结果充分地支持使用AFQ056 治疗 FXS 的进展，更大范围的在多个国家使用双盲安慰剂对照的为期3个月的试验，评估服用多剂量的AFQ056(clinicaltrials.gov)的效果32]。STX107(海滨治疗)的I 期试验已经在健康个体中完成(没有提供结果)(clinicaltrials.gov)32】。人们也在患有FXS 的成年男性和女性中正在进行R04917523的双盲安慰剂对照剂量检测Ⅱ期试验(Roche)(clinicaltrials.gov)。
在临床试验中，人们针对检测治疗 FXS 和 ASD 的 GABA 能系统中 GABAB受体1的激动剂R-巴氯芬，发现GABAB R1亚基的表达在FMR1 KO 小鼠的脑中减少。人们认为巴氯芬通过抑制神经元的突触前释放谷氨酸，进而阻断来自 mGluR5 的下游传导信号37】。来自Seaside Therapeutics的未公开报告指出，使用 STX209(Arbaclofen,R-巴氯芬)的治疗改善了患有FXS 的个体的社交和交流能力，而在ASD 患者中，改善了多动症、言语障碍和重复相同动作的行为

188 自闭症的异常基因调控：从转录到翻译
(www.seasidetherapeutics.com)。
通常用于治疗双相性精神障碍的锂，最近已被测试可用于治疗 FXS102]。锂抑制磷脂酶C 和糖原合成酶激酶-3β(GSK-3β),在 FMRI 无效小鼠脑中，其酶的活性有所升高。锂对FMRIKO小鼠的一些行为表型有逆转治疗作用，对神经突棘表型起部分治疗作用104-106]。它还能纠正FXS 模型的果蝇的认知损伤。对患有FXS的15名受试患者[108,人们首次系统性探索地进行了短期(2个月)锂开放标记性试验治疗。治疗显著改善了病人中FXS行为特性中的适应差的行为、行为专注和言语记忆。此外，锂治疗纠正淋巴细胞ERK的延迟激活，提示锂可能直接调节mGluR1/5 下游和上游的翻译信号通路。总之，结果表明使用锂有治疗FSX的可能性。
广泛使用的抗生素米诺环素，对自身免疫性疾病如类风湿性关节炎有神经保护和抗炎作用，最近也已应用于FXS的治疗研究中109]。在一项研究中，米诺环素显示对 FMR1 缺陷小鼠中脊柱的突棘形态和行为技能有改善10。其作用机制是降低升高的基质金属蛋白酶-9(MMP-9) 活性，这种蛋白酶与相关的神经突触重建的可塑性上起作用。MMP-9 蛋白水平在野生型小鼠中和在FMR1 KO小鼠的基础条件下通过mGlu1/5 刺激而增加110]。在20名约12岁患有FXS的病人中111,开放标记的米诺环素试验显示，与FXS 相关的多项行为得以改善。这些结果对患有FXS的儿童和青少年的双盲安慰剂对照的米诺环素试验提供理论依据。已经报道米诺环素的许多不良反应(如牙齿不可逆地永久性地变成黄色/棕色，呕吐及/或腹泻，药物诱发性狼疮和假性脑肿瘤112),人们因而在临床试验中减少对米诺环素的继续使用³2],然而人们仍然希望开发出针对MMP-9的更特异的药物来。
此外从 FMR1缺陷小鼠的研究中更多的靶点，包括两种酶——Rac1 小 GTPase和相关的p21激活激酶(PAK),它们调节神经突棘中的肌动蛋白的聚合，并且对可塑性起作用。另外，通过出生后显性抑制型PAK的表达实现的遗传补救，可以逆转FMRI null小鼠的某些FSX 相关表型并促进PAK 特异性抑制剂的形成(www.afraxis.com)。
人们已经开始探索在FXS 病理生理学治疗中另一个途径是，针对NMDA使用拮抗剂memantine⁵] 。一项开放标记性临床试验表明，memantine 在临床总体印象衡量中显示大约35周的改进115,在全世界具有临床效益。这些比较乐观的结果促进了一项随机、双盲、安慰剂对照研究(http://clinicaltrials. gov),尽管研究集中在突变前携带者身上。
FXS和ASD中的三种主要治疗策略是：①针对上游细胞外神经递质的受

第11章自闭症和脆性X 综合征的翻译控制 189
体，例如mGluR5和 GABAB 受体；②针对细胞内中心信息传导途径,如 ERK1/2 或 PI3K; 和③针对从FMRP 靶向mRNA( 即GSK3b,MMP-9或PAK) 翻译而来的多种信号分子。FXS和 ASD 在分子和突触途径中出现显著的交叉，其中很多是在控制mRNA 翻译的过程。对FXS的靶向治疗很可能会针对自闭症患者的失调机制，例如在mRNA 翻译途径中发生缺陷的自闭症患者亚群。通过调节蛋白质合成机制，我们将有可能治疗许多由翻译失调引起的神经发育疾病，包括FXS,ASD和相关疾病。

本章要点

●mRNA的翻译主要是通过信号传导途径在启动步骤得以控制，例如 ERK, PI3K/mTORC1。
●这些信号传导途径的失调与自闭症谱系障碍(ASD) 和脆性X 染色体综合征(FXS)相关。
●临床前期的证据提示，干预针对这些信号传导途径可以使与FXS 和 ASD 相关的表型免于受损。
● 代谢型谷氨酸受体1/5(mGluR1/5) 控制翻译依赖的突触可塑性，并与FXS 病理生理学相关。
● 使用mGluR5 拮抗剂的早期临床试验未见不良反应并显示 FXS 和 ASD 改善的征象。
● 人们也正在考虑针对蛋白质翻译的总体过程或翻译异常的蛋白质的其他潜在疗法。

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表观遗传的，环境的和生理的因素对自闭症的影响

第12章

自闭症的表观遗传学

Matthew    Ginsberg,Marvin    Natowicz 石寰译，丁岩孔学君校

摘要
尽管我们在导致自闭症的遗传因素方面有许多成果，但仍对很多自闭症患者的病因所知甚少，而且对自闭症患者大脑中的潜在生物学机制也不甚了解。表观遗传学或许可以从单基因和染色体突变方面解释某些自闭症病例的起因。在这一章我们将讨论表观遗传在自闭症病理生理学方面出现的调节异常的一些最新证据，以及研究自闭症的表观遗传学过程的挑战和应对策略。
关键词：自闭症；表观遗传学；DNA甲基化；组蛋白；遗传学。

前言

很多单基因病变、染色体异常和接触致畸的环境是导致自闭症表型的主要因素。然而，只有5%～20%的自闭症是由染色体异常导致，其他已知因素导致的自闭症比例更少1-4]。大多数人患有孤独症没有病因的依据，并归类为特发性，并且有很大的异质性。例如，历来用于定义自闭症的典型的三大症状，在多个独立的研究中只有中度协方差5-71。
尽管有异质性，但还是有大量的确凿证据证实自闭症是有高度遗传性的。在对双胞胎的研究中可见最令人信服的证据，同卵双胞胎中显示90%的同病一致率，而在异卵双胞胎中大大下降。如果考虑更广泛的自闭症表型，这些分析数据会略有不同8-12】。然而，尽管已发现100多个单基因和染色体拷贝数损益风险基因位点[1³,这些突变仍无法解释大多数自闭症的罹患风险。最近，探索其他病因开始引起关注。自闭症的高遗传性及尚未识别的导致自闭症的遗传位点，是大多数自闭症的病因学基础，Beaudet 指出，表观遗传可能是自闭症的主要致病因素[2。

202    表观遗传的，环境的和生理的因素对自闭症的影响

表观遗传学是指稳定的染色质变化所引起的基因表达，与 DNA 序列的变化无关。在这一章我们将综述表观遗传生物学的基本特点、表观遗传生理学与病理生理学在中枢神经系统的作用，然后讨论表观遗传因素引发自闭症的证据。最后，我们将讨论表观遗传学对自闭症研究现状的影响，该领域研究中的挑战和可能的发展途径。

表观遗传学的基本原理

表观遗传信号是指染色质稳定的非序列变化引起的基因调控(图12-1)。从本质上说，表观基因组相当于一种调控的“泥”,形成一种持续对诱导物有反应的特定状态，即使这种诱导物不是一直存在。这些信号所建立的基因表达模式是细胞分化，女性X 染色体失活、遗传印记(指来自父亲或母亲的等位基因的沉默状态)及其他重要过程所必需。

图12-1 典型的表观遗传机制。DNA 形成的异染色质 (紧缩)或常染色质(宽松)及相关组蛋白复合物。DNA 甲基转移酶(DNMT)产生DNA甲基化，通过抑制转录因子的结合和促进甲基绑定区域(MBD)的蛋白质(如 MECP2)的绑定从而抑制基因的表达。这些蛋白质的复合物，包括组蛋白去乙酰化酶和染色质重塑复合物如 Swi/Snf。常染色质是与缺乏甲基化的DNA 和转化后修饰的特定组蛋白，如在赖氨酸的4点甲基化或在不同残基乙酰化；HAT= 组蛋白乙酰转化酶；HDAC= 组蛋白去
乙酰化酶

表观遗传信号可由不同的分子过程产生。表观遗传信号包括：①在CpG 二核苷酸处直接甲基化胞嘧啶残基(即胞嘧啶后直接连着一个鸟嘌呤);②共

第12章自闭症的表观遗传学 203

价修饰组蛋白；③核小体定位/染色体重构(沿DNA 滑动的组蛋白轴);④稳定的、染色质相关的非编码RNA。这些信号也需要大量的介质来有效地调节基因关于蛋白质和非编码RNA的表达。表观遗传标记通常通过有丝分裂继承；虽然大部分的表观基因组在减数分裂过程中重置，也有证据显示可继承的表观遗传基因组的变化是通过减数分裂发生的21]。DNA甲基化一般由DNA甲基转移酶DNMT1,通过DNA复制维持。组蛋白翻译后修饰的维持和核小体定位可能是依靠依赖ATP的染色质重塑的蛋白质的复合物，如SMARCAD1,但人们对此还知之甚少22]。
对这些变化的基本分子生物学研究已广泛开展。然而，下面的讨论有几个要点仍值得一提17,23。首先，通过 DNA甲基转移酶的作用在CpG 二核苷酸处胞嘧啶甲基化的发生。甲基化通常发生在基因组胞嘧啶鸟嘌呤二核苷酸 (CpG) 的胞嘧啶上5'的位置，但甲基化在CpG 二核苷酸密集的称为CpG岛处发生更多变化。这些 CpG岛一般位于启动子或基因内的非编码区来调节相关基因的表达，也有的CpG岛位于其他位置24,25]。
组蛋白是与DNA相关的形成染色质的蛋白质。组蛋白H2A、H2B、H3 与H4 形成八聚体，DNA 缠绕其上构成核小体，可调节转录因子及RNA 聚合酶靠近 DNA。对核小体组蛋白的共价修饰引起染色质结构的变化，从而影响相关DNA的甲基化和转录。一些重要的修饰包括组蛋白甲基化和组蛋白乙酰化。一般情况下，组蛋白乙酰化使组蛋白与DNA链接松弛，留给转录更大的空间。在特定残基的甲基化，如组蛋白3赖氨酸9(H3K9) 处，与基因阻遏有关，而其他位点，如组蛋白3赖氨酸4(H3K4), 甲基化则与基因活化有关。
ATP依赖性酶系作用于多亚基复合体定位核小体，参与染色质结构的重塑。以前人们认为这些进程是转录因子与 DNA 结合的过程，但现在人们认为复合体的重塑有发育和组织特异性，并调节转录和染色体结构。
表观遗传机制在中枢神经系统中，尤其是在其早期发育中起着重要而独特的作用。目前人们只详细探讨了少数印迹的位点，证据表明，尤其是在大脑中，可能有大量两性异型的X 染色体和常染色体显性遗传的基因印迹,形成了丰富而复杂的调控环境，与性别差异大的中枢神经系统疾患如自闭症有直接相关。染色质修饰也对某些形式的记忆是必需的，而且与认知功能障碍有关³1。几种染色质修饰酶可能与发育期间低误差容忍调节系统的重要代谢和细胞周期控制有关，并与可能导致自闭症的几种基因产物相互作用32]。
非编码RNA 在调解表观遗传信号中具有重要作用，但人们对其机制了解甚少，并没有像其他类型的表观遗传信号更具有持久性。因此，虽然它们在导致自闭症时可能被阻断并引起一些表观遗传效应，我们将不对它们进行详细讨论。

204             表观遗传的，环境的和生理的因素对自闭症的影响

表观遗传学在疾病中的影响

表观突变是一个异常的表观遗传信号，导致基因的表达异常。对于异常表观遗传信号的研究多集中在肿瘤，其突变发生在体细胞系统中333。最新研究成果发现了表观遗传病理在中枢神经系统，包括一些神经精神疾病如抑郁症、吸毒成瘾、癫痫持续状态和精神分裂症的作用34-39]。
我们可以从几个方面来解释表观突变的概念(图12-2)。有一种方法是通过表观突变产生的方式来分类。这种分类有助于了解一种疾病的病理生理学机制，并分析多大程度上可以修改表观突变或如何预防其发生。这种分类涉及三种模式：①在专性模型中，一个特定的基因型总是与一种特定的表观基因型(表观突变)相关；②在促发模型中，一个特定的基因型对表观突变可以促发但不起决定性作用；③在新生模型中，基因型不导致表观突变。后两个模型表明表观突变可能是可逆的，而且更可能受环境变化所影响。

自闭症儿童的母亲SAH水平较高。 SAH是Dnmtl的抑制剂，可能导致全面低甲基化

丙戊酸是具有多种作用机制的药物，包括抑制HDAC 。怀孕期间丙戊酸盐的使用与自闭症和神经发育障碍的风险增加有关

Relt 综合征是由Mecp2 突变引起的，导致许多基因的过多表达和过低表达。表型主要在发育/神经系统，并显示与自闭症有一些重叠
PW和AS有时由PWIAS印记区域中的异常甲基化引起，代表纯粹的表观突变

脆性X综合征是由FMR1的5非翻译区CGG重复的扩增引起的。这引起基因的高度甲基化和沉默状态，导致特征性的表型

图12-2表观遗传在神经发育疾病中的阻断作用。表观遗传机制的阻断导致某些神经发育异常。这些机制包括对主要效应器上蛋白的代谢或毒性的抑制，使基因转录效应器的蛋白失活，使自闭症风险基因的表观遗传失活的突变，及这些自闭症风险基因的单纯表观突变。 PW, 普拉德-威利综合征；AS, 安格尔曼综合征；SAH,s-adenosylhomocysteine;HDAC, 组蛋白去乙酰化酶；DNMT,DNA甲基转移酶

第12章自闭症的表观遗传学 205

另一种分类系统与表观突变的靶点有关，更具体地说就是，是一种表观突变使单个的自闭症风险基因失活(相当于传统的遗传突变),还是多种表观突变对主要表观基因组的破坏而导致的多个自闭症风险基因(也可能是和自闭症无关的基因)的灭活。这种分类方法更接近表观遗传起决定性作用的疾患的病理生物学机制。
还有一种突变的分类是从结构变化来考虑，即基于对表观遗传功能失调的组成成分的分类，是固有的还是获得性的。在此分类方法中，突变可能是由于异常的DNA甲基化、组蛋白甲基化、组蛋白乙酰化、染色质组成成分重组等。其中每个类别又明显地继续分类别，如对特定的染色质重组基因突变分类和不同异常DNA 甲基转移酶的分类。
我们将讨论几个自闭症的综合病症，来举例说明这些自闭症风险的分类类型，从病理生理学角度来看更容易理解。我们还将讨论环境对表观遗传学的影响及表观遗传对非典型自闭症综合病症失调作用的证据的影响，病理生理学在这方面解释得不太清楚，但表观遗传模型对自闭症的综合病症的研究方向可能会起到指导作用。

综合征类自闭症

我们以几例遗传综合征来说明表观遗传失调的模型。我们将讨论三种综合征，有助于解释突变的产生和延续自闭症的表型的不同机制的模型。
脆性X 染色体综合征
脆性X 染色体综合征是一种X 连锁基因的疾病，具有智力发育迟缓、畸形，及自闭症表型高发病率的特点，是由CGG 三核苷酸在FMR1 基因的5'非翻译区的重复延伸而引起的。例如，当FMRI 基因的5'非翻译区延伸超过 200次，DNA序列几乎总是发生高甲基化，从而使基因和蛋白表达降低，导致下游信号的异常[42.42】。由于基因型决定基因的甲基化状态，可以分类为单个基因失活的固有性表观突变(图12-2)。
最近基于对大量通路障碍的病理生理数据的研究，探测了使用mGluR5 代谢型谷氨酸受体的抑制剂，以改善脆性X 染色体综合征的症状。有趣的是，这样一种化合物，小型临床试验的初步结果令人失望，并不支持我们的理论，但分析后调查人员却发现了一个令人惊讶的假设[43】。临床试验发现所有被测患者的FMR1 基因都发生了突变，但在5′非翻译区却发生不同程度的超甲基化。只有具有完全甲基化等位基因的患者，在临床试验期间症状有显著的持续性的改善，而那些有部分甲基化的患者症状并没有表现出改善。这表明即

206    表观遗传的，环境的和生理的因素对自闭症的影响

使在表观遗传疾病的固有性模型中，有些可能是由环境引起的，甚至是可治疗的。
Rett 综合征
虽然Rett 综合征未被归类为DSMV 中特定类型的自闭症，根据诊断和统计手册第4册44,Rett 综合征以前被认为是一种广泛性发育障碍。它是由X 染色体上的MECP2 基因突变而产生的一种蛋白质引起的，这种蛋白质与甲基化DNA(甲基蛋白结合区域)结合并影响多个基因的转录。这种表型与典型自闭症有很多共同特点，包括缺乏语言表达能力和在达到ASD 标准的短暂期间厌恶社会交往。表型的病理生理基础是控制终端的分化和成熟的神经元，包括细胞信号、代谢、细胞架构和神经保护的基因的调节异常。MECP2结合甲基化DNA并与更多调控成分如组蛋白去乙酰化酶(HDAC) 抑制基因的表达，但也通过其他机制起作用47]。全基因组分析揭示 MECP2 实际上并不是只与转录抑制相关，它与非甲基化的基因组区域也相关，但也可能启动某些基因。Rett 综合征是固有性模型影响表观遗传的许多基因失调的病例。事实上MECP2 基因突变所导致的甲基化依赖型的基因调控的广泛功能障碍及主要神经发育表型的产生，显示在中枢神经系统的形成中表观遗传机制的重要性。几种其他MBD蛋白质和表观遗传机制的核心成分发生突变引起自闭症的表型，提示一些少数的自闭症群体发生的突变对广泛的表观遗传失调症具有影响力5¹]。
安格尔曼综合征(Angelman syndrome)(也称天使综合征)
普拉德-威利(Prader-Willi) 和安格尔曼综合征都是由15号染色体的印迹区域的异常引起的。特别是安格尔曼综合征与典型自闭症有很多共同的特点。普拉德-威利综合征通常是由从父系继承而来的15q11-13区的删除引起的，而安格尔曼综合征通常由母系继承在这一区域的删除引起，因而该区域的印迹使从另一方父母亲来的正常等位基因失去作用。尽管引起普拉德-威利综合征的精确基因仍不得而知，但有证据证明安格尔曼综合征是由泛素 E3A连接酶 UBE3A的损失造成的。突变的印迹中心调节印迹过程(固有型或获得型),或特定基因组区域或重要基因的重新突变偶尔导致的病变有重要的意义(图12-2)。此外，PW 及 AS 中15q11-13区域的复制也导致包括癫痫发作和自闭症表型的一种综合征。证据表明，复制导致该区域和其他印迹基因组基因位点甲基化的异常55。重要的是，传统的遗传技术无法测出重新突变，因而，虽经过大量遗传检测，仍无法查出一部分特发性自闭症患者的病因。此模型也解释了环境机制对自闭症的作用。

第12章自闭症的表观遗传学 207

环境表观遗传学

自闭症的患病率目前逐渐增高56]。患病率的增高是自闭症确诊率的单纯反映还是发病率的真实增加仍有争论。然而，如果自闭症的发病率增加，不会由风险等位基因的频率增加而引起。此外，在同卵双胞胎的一致性不是 100%,这表明一些环境因素起了一定的作用。表观遗传机制对基因与环境的相互作用具有很好的调节力，从而解释增加的ASD 发病率(图12-2)。
例如，甲基组代谢异常与疾病之间存在关联。几项研究显示在自闭症与叶酸代谢的多型性基因有关57-60]。叶酸代谢是甲基组通过其辅助同型半胱氨酸蛋氨酸循环代谢维持的必要条件。这个过程对在其他代谢途径中的 DNA 甲基化起关键作用。此外，产妇叶酸载体基因的多型性与风险增加的自闭症后代有关，这种风险是与父系或先证者的基因型状态无关，因而宫内叶酸代谢紊乱可能增加自闭症的风险。这与流行病学提供孕前期补充叶酸预防自闭症发育的证据一致。
自闭症也可能与产前暴露于药物63,64]、感染65,66及一些环境毒素(如内分泌干扰物)有关67】,可能通过表观遗传机制而发挥其作用68,69]。上述都可能是表观遗传蛋白质的调节紊乱或非编码RNA 影响多个基因所致。
接触或服用某些特定药物可以改变在中枢神经系统中表观遗传调控的基因，意味着这些位点可能是潜在的治疗靶点。对表观遗传学改变能够产生积极影响的几种药物已经开始对其他疾患如癌症、精神分裂症可能起到治疗作用6⁹- 711。

非综合征型自闭症的表观遗传失调

虽然我们仍不清楚突变是一个遗传变异的结果还是不止一个变异发生在患者身上，最近的研究还是直接支持表观遗传对非综合征型自闭症的这一假设。为了验证这个想法，虽然目前还没有识别哪个特定基因的突变，但研究发现一个有家族自闭症的人，其催产素受体基因(OXTR) 启动子的甲基化增加，同时基因的表达发生减少。尸检分析揭示，一组独立的自闭症患者的大脑中颞叶皮层比对照组大脑标本的OXTR 更显著地发生甲基化和低表达72]。催产素信号的调节紊乱很可能导致自闭症的社交行为表现73】。
另外一些异常DNA甲基化随后在少量特定的自闭症风险候选基因位点上发现。例如，在自闭症患者的大脑中观察到UBE3A启动子的甲基化⁷4]。正如前面我们提到过UBE3A 与几种综合征型的自闭症形式有关。 MECP2 启动

子异常甲基化在少量自闭症的患者中也被识别出来75]。这些研究只针对一些特定的风险基因，这些突变是否是整个表观基因组广泛基因变异的一部分，目前尚不清楚(MECP2 情况除外)。
然而，使用高通量全基因组检测的DNA甲基化或组蛋白的修饰的研究，能识别整个基因组表观遗传中断的模式。一些研究工作者已经利用这种技术在拥有相同基因组的同卵双胞胎(MZ) 上，把从基因组变异引起的固有的表观遗传变异与单独重新测序的表观遗传变化分离开。对MZ双胞胎的淋巴母细胞株全基因组扫描中发现了一些非常有意义的甲基化分化区域和基因表达谱的参照数据都来自同一样品76,7】。BCL2 和RORA甲基化改变的两个基因，在一组自闭症患者大脑的尸检中发现与蛋白质产物水平变化有关。另一项对6对不同MZ双胞胎的甲基单胞体的研究表明，在双胞胎中存在许多分化的甲基化区域(DMR),该区域(DMR) 也存在于自闭症和非自闭症双胞胎之间和特定症候区域中78]。尽管这些研究为随机和导致自闭症表型的环境因素提供了支持证据，但它也有局限性。首先，对MZ 双胞胎的评价丰富了遗传性疾病的标本，但我们不能把结果推断到更广泛的ASD人群中。第二，大部分的这些研究已经证明，甲基化差异与典型的双峰分布的DNA甲基化的差异相对较小。虽然这种差异可能代表生物变化，但该设计下的研究没有对多项假设试验的统计学意义结果进行很严格的筛选。因此，结果可能反映一些假性关联。最后，在这些研究中，尚不清楚实验检测的周围组织是否可以代表大脑中表观遗传模式，这是在发育过程中建立的组织特异性的表观遗传模式的一个重要问题。
对自闭症患者脑组织的少量尸检研究，试图在非综合征型自闭症人群中找出相关解剖位点的表观遗传失调。我们自行对全基因组DNA甲基化的检测发现，在小脑半球或枕叶皮层，根本没有广泛的过高或过低的甲基化⁷91。此外，虽然我们没有能力统计出各组之间的细微差别，在9个病例组和9个对照组中我们确定无显著 DMR,其中包括几个自闭症的风险基因 MECP2、 OXTR、BCL2 或 RORA。Shulha 和他的同事们分析了16组自闭症及对照组前额叶皮层组蛋白的异常修饰。在4个大脑内多个自闭症风险基因上识别出组蛋白赖氨酸4处的三甲基化的异常延伸。从独特的和最相关的细胞类型中分离出的神经元细胞核说明了表观遗传异常，也更证实了这项研究。
虽然这些研究方法多种多样，并得出不同的结论，但它们有一致的发现，就是有关的表观遗传因素在自闭症发病机制中的作用。首先，所有研究全基因组的表观遗传信号，无论在血液或脑组织，没有发现广泛的表观遗传调节紊乱的证据(即，针对不同的DNA甲基化和组蛋白修饰的整体水平没有找到证据)。这表明，表观遗传异常对个体自闭症来说，可能影响相对较少数量的基

第12章自闭症的表观遗传学    209

因。第二，所有研究都注意到自闭症群体中的不寻常的异质性。识别到的 DMR通常是存在于一个或几个病人身上，这与遗传和基因型水平的异质性一致。第三，对自闭症大脑内RNA的表达的几个全基因组的研究已经启动，并产生更可靠的结果；人们象对基因突变那样，开始针对自闭症表观变异进行研究79,81,82。

表观遗传失调的可能来源

表观遗传失调如何影响自闭症表型?首先，在一些自闭症人群中，在种系中建立的重新测序的表观突变可能使基因异常地不表达(或去抑制的沉默基因),与自闭症的很多生物通路发病机制，如突触的形成和维护、神经递质通路、细胞周期调控，都和细胞凋亡有关83。第二，重新测序的表观突变或标准突变能失活或改变基因的剂量，从而影响表观遗传机制的蛋白质的翻译，造成更多的广泛的功能障碍，如Rett 综合征或Rubinstein-Taybi综合征中所表现的功能障碍。通过对自闭症病例的全外显子组测序来研究突变，支持突变的基因与染色质维护有关这一假说。此外，非编码RNA弥补了基因组的很大一部分，是表观遗传机制的关键调解物质85,86]。鉴于很大比例的自闭症是特发性，尽管从遗传角度评价自闭症，主要针对外显子组和其高遗传性，这是一个很值得考虑的重要的假说。第三，在减数分裂和传递性调控RNA中甲基体的不完全重组导致某些突变甚至可能是可遗传的。最近一项研究表明，父亲的饮食可能会影响基因的甲基化、基因表达和F1 子代表型，从而验证在哺乳动物中的表观遗传。第四，最近证明非印迹、特异性等位基因的甲基化是常见的，而且直接关系到顺反子的变化。这种变异体在自闭症发病机制的 “多击”假说中可看作是其中的“一击”。

未来方向

在表观遗传失调的自闭症研究中，有很多来自技术和生物局限的挑战。
对于DNA甲基化，组蛋白翻译后修饰，总RNA 和核小体定位的方法的优点和缺点的评估已经有很详尽的综述。未来研究的最重要的挑战之一是统计。现在高通量技术可以快速、准确地测定全基因组表观遗传的变异。然而，这些研究需要阐述多重假设的检验问题。检测相关的突变可能是统计上的局限性。例如，如果X 染色体的表观突变发生在一个单一的、关键 CpG 二核苷酸的自闭症风险基因的高甲基化上，病例组和对照组甲基化状态区别的全基因组分析需要非常一致。然而，自闭症是一种异质性疾病；已经有大量的

210    表观遗传的，环境的和生理的因素对自闭症的影响

已知的罕见的病理拷贝数量的变异物质，单基因疾病和代谢紊乱与自闭症相关。相关的突变可能会彼此不同，使识别它们的病例-对照研究有难度。我们有一些解决问题的方案。进一步分组研究有关内在的表型有可能帮助减少自闭症的异质性。另一种方法是通过评估下游的影响，间接地尝试认识新型突变。单一的表观突变，如同基因突变，可能导致大量的RNA 或蛋白质水平的异常现象。生物信息学的方法研究转录组和蛋白质组的数据可能会产生重要的表观遗传假说。
因为在细胞系的发育和分化中建立的组织特定模式，对表观遗传研究中的相关组织的研究是另一项挑战。因此，对特定的基因位点，周围组织通常可能发生甲基化，而大脑则发生去甲基化，而在疾病状态下，两者都可能发生甲基化。在这种情形下，外周组织则可能不会发生表观突变。某些或很多突变可能会在多个组织内出现，但对任何组织所进行的检测，应对照脑组织进行验证。甚至同样的大脑的不同区域，或特定神经元群体可能有独特的表观遗传特点或突变，而且这种变化可能是具有年龄特异性，都给这一挑战平添了复杂性。由于采集的人脑组织是具有挑战性的，所以有必要建立动物模型，这样可以高度概括自闭症大脑中的表观遗传异常。一种方法是寻找自闭症综合征在不同的动物模型中的常见表观遗传异常。此外，从外周组织提取的诱导多能干细胞的使用可分化成神经组织。然而，根据表观遗传失调的来源和使用方法，这些细胞中的表观遗传特征可能会在中枢神经系统组织中复制。有效地利用现有的尸检和手术源性人脑组织也将必不可少，从而更好地了解正常人类表观遗传的脑部发育。
最后，不同于全基因组，表观基因组是可修改的，而且许多精神药物在自闭症患者身上的使用可能会影响表观基因组及偏差的研究。流行病学调查可能需要排除、匹配，或控制药物的使用、年龄和其他相关的协变量，进而影响表观遗传学研究的结果。

结论

认识自闭症的发病机制及病理生理极具挑战性。尽管自闭症具有高遗传性，传统的遗传分析不能揭示绝大多数病例的常见突变。相反，数据提示这些疾病错综复杂，可能有多个病因并涉及多个生物学通路。然而，表观遗传至少在某些自闭症起作用并有以下证据：①某些神经精神障碍由表观遗传机制介导；②几种表观遗传失调的综合征与自闭症具有重叠特征；③初步研究显示特定基因的异常表观遗传调控与自闭症之间的直接联系。遗传和表观遗传的异常的同时存在，可能作用于多个生物学通路，并且在每个病人

第12章自闭症的表观遗传学 211

身上有不同的特定基因突变和表观突变。这项研究的影响并不仅仅是纯学术上的。而且药物可以针对病理表观遗传修饰；实际上这些疗法已经运用在肿瘤和不典型增生的疾病上。此外，环境危险因素对自闭症的影响有助于预防方案的制订。自闭症患者外周组织的独特表观遗传标记的识别，也可以帮助建立诊断和细分自闭症的有效生物标志物。对这些工作的进一步跟进，来验证我们的研究结果，并找出任何可能用于诊断或治疗自闭症的共同通路的工具。

本章要点

●表观遗传调控信号是稳定的，染色质的非序列更改影响基因的表达。
●表观遗传机制对人类大脑发育是特别至关重要的，并与神经发育障碍和自闭症综合征有关。
●在广泛的自闭症人群中，表观遗传异常可能会在自闭症病理生理学的基础上提供新的直接证据。
●表观遗传失调引起自闭症风险基因突变的形式，可以是传统的突变，核心的表观遗传调控蛋白的突变，或者是使自闭症风险基因失活的单纯的表观突变。
●表观遗传调控提供了基因及环境的相互作用可能影响自闭症风险的机制，还提供了靶向治疗的机会。
●研究自闭症表观遗传因素面临的挑战包括技术/统计上的局限，组织标本的获得和病情的复杂性，但也有很多应对的策略是富有前景的。

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第13章

自闭症的表观遗传学 ——超越碱基的传递

SimonG.Gregory
周洋译，陈一心孔学君校

摘要
以往的研究已经证明，ASD的发生具有很强的遗传因素，但这些遗传风险因子并不能解释这一障碍的所有遗传可能性。而表观遗传的另类机制在ASD的作用很有前景。表观遗传机制促进基因表达的时空调控，和DNA 构成序列的变化无关。因为表观遗传模式是不稳定的，为一种值得关注的环境影响机制：它不足以改变细胞的DNA序列，但可能会改变基因表达和细胞反应，从而导致ASD。在这一章中，我们将讨论DNA甲基化和组蛋白修饰在ASD发病中起到的作用。
关键词：自闭症；表观遗传学；CpG岛(胞嘧啶-鸟嘌呤磷酸岛);DNA甲基化；染色质；组蛋白修饰；环境影响；发展；组织特异性。

前言

自闭症是一组由遗传易感性与环境影响复杂的相互作用导致的谱系障碍。大量研究工作已经揭示引发ASD很强的遗传因素，然而，前期研究已经表明，与任何一个单基因相关的ASD病例都不超过2%1。尽管遗传学研究的规模已扩大至能够探测越来越小的遗传效应，可以明确的是，DNA 序列中的危险因素并不能解释所有导致ASD的遗传性要素。这提示了一个值得关注的研究前景：选择性的表观遗传机制在ASD的发展中可能也起了一定的作用。
表观遗传学是一个名词术语，由Waddington在1942年2首次用于描述对基因表达的时间和空间起调控作用、而独立于DNA 构成序列的变化的遗传现

220    表观遗传的，环境的和生理的因素对自闭症的影响

象。表观遗传模式是不稳定的，由此表现为一种有趣的机制：它不足以改变细胞的DNA 序列的环境影响，却可能会改变基因表达和细胞反应。这种表观遗传机制会引起疾病的发生发展，可能是通过起源于子宫内、一生存续、甚至遗传自父母和祖父母的持续性影响。表观遗传学这一名词包括数种基因调控的机制，包括非编码区和微小RNA(曾在第八章和第九章讨论过)、组蛋白修饰和 DNA甲基化。本章将讨论后两者对 ASD发生的影响。

DNA 甲基化

DNA甲基化是指在位于鸟嘌呤的5'末端的胞嘧啶环上的5位碳原子添加了甲基基团，这两个碱基间由磷酸二酯键相连，简写为‘CpG' (图13- 1)。甲基化的过程由环境依赖的DNA甲基转移酶(DNAmethyltransferases,DNMT)催化。例如，DNMT1 参与维持DNA 复制中的子链的甲基化，而转移酶家族中 DNMT3A 和 DNMT3B 则在发育过程中对新生甲基化的建立起重要作用。 DNA 的新生甲基化和维持已有的甲基化已为人所熟知，而去甲基化直到近期仍未得到较准确的定义。研究发现，通过10-11易位(ten-eleven translocation,TET) 酶家族的催化，5-甲基胞嘧啶迭代氧化为5-羟甲基胞嘧啶(5hmC) 、5-胞嘧啶甲酰(5fC)和5-羧基胞嘧啶(5caC), 这是一个动态的胞嘧啶修饰模型(图13- 2)³ 。5hmC在ASD发展中的潜在重要性，是基于其在中枢神经系统中神经细胞内的丰富含量4,5]。大脑中一些区域的甲基化/去甲基化已被证明是神经发育中的一个动态的过程，而在小鼠模型中也已证实6,5hmC甲基化较丰富的区域分布，定位于特定的基因组区域。有趣的是，基因组甲基化的减少和增加和组蛋白修饰(如组蛋白3第27位赖氨酸的三甲基化)似乎存在相互协同的作用6。
尽管DNA甲基化被认为主要是CpG 区间内胞嘧啶的甲基化，哺乳动物干细胞中还包括CpA 和CpT 的甲基化，但分化细胞中的绝大多数(>99%)DNA甲基化作用发生于CpG7,8] 。DNA甲基化谱在生殖细胞的分化、发育和早期胚胎发育过程中不断变化⁹,研究进一步印证了表观遗传模式的过渡性特点。

AC
G

G
T    A GC
A

图13-1 DNA甲基化和染色质修饰的示意图

第13章自闭症的表观遗传学——超越碱基的传递    221

图13-2胞嘧啶甲基化和氧化循环

胚胎形成过程中的环境对于建立表观遗传学标志至关重要，因为重编码发生于受精后短时间内和生殖细胞分化过程中。尽管去甲基化和重新甲基化的机制是一个活跃的研究领域，我们已知许多因素包括甲基的可利用性、环境毒物的接触和/或其他压力源，都可能会影响这一过程，并且可能会有远超过发育时期的效应。研究证实大量环境因素包括营养、毒素和压力在内，都具有表观遗传效应10]。最后，DNA甲基化谱通常随衰老而改变，这种改变作用是相互的。例如：衰老过程可以影响甲基化谱，而 DNA 甲基化过程也可以影响衰老。
基因组内大约有2800万 CpG 二核苷酸，其中约有60%～90%被甲基化¹2,13]。分化细胞内许多关键生理进程需要CpG 二核苷酸的甲基化(70%与鸟嘌呤相邻的胞嘧啶被甲基化),包括X 染色体失活、印记(基因表达依赖于亲本表达)、种系特异的基因沉默以及序列重复元素。然而，很多年前我们就已得知，正因为基因的启动子区中无DNA甲基化过程，才使其能够通过影响转录复合体与基因的启动子区结合的亲和力来调控基因表达[¹5]。与基因表达相关的甲基化调控的基本区域是CpG岛(CGI) 。CGI是一些多于200碱基对的基因组区域(>200bp), 其中GC的百分比超过50%,CpG 的观察数与预期数比率超过60%。尽管 CGI 多年来一度被认为是基因表达的主要表观遗传调控者，近期的研究关注点聚焦于CGI 滩(在CpG 岛每一侧翼均向外延伸出2000碱基对的区域)的甲

222    表观遗传的，环境的和生理的因素对自闭症的影响

基化状态。这是因为比起CGI 本身，CGI 滩的甲基化状态可能更密切地调控基因表达，在体细胞突变造成的疾患及神经细胞中都是如此，他们的基因组上富含甲基化的区域包含了与转录因子结合的基因序列位点18,19]。此外，CGI 沿定义中的甲基化区域有更大的尺寸，在CGI 滩外再两边均延伸出2000个碱基对的区域，这可能也会影响基因表达的调控(图13-3)。

肝脏

ccser
-2000bp

CCI Shore

-2000bp

CGIShore+2000bp

cclsel+2000bp
Adapted from Irizarry 2009

图13-3CGI岛、滩和沿

DNA 甲基化的调控

CGI岛以及CGI滩和CGI 沿，通过表观遗传学的甲基化以启动或停止转录过程的运转，不仅是在发育过程中进行时间上的调控,而且在不同组织类型中也有空间上的调控。后者，即DNA甲基化的空间多样性，解释了包含相同遗传物质的一个细胞，当作为体内不同类型的细胞时，能够以组织特异性模式发挥其功能。然而这也意味着，脑组织的甲基化谱就和血液的不同。这在ASD研究中十分重要，因为近端组织——大脑，显然是无法从活体患者身上获取的。而尸检标本作为一种可获取的材料来源，其个体的潜在局限性可能会影响其作用，比如死亡的方式、死后间隔时间以及可获取的数量限制。因此，使用量大又极易获取的血液样本来就大脑中的表观遗传学失调进行研究，便有其巨大的优势。血液中的DNA 甲基化类型并不能准确表述脑组织中的甲基化类型，特别是在脑组织中不同部位也有不同的甲基化类型，但与发育障碍如ASD 相关的表观遗传学特征可能发生于发育早期、甚至可能在子宫内 (见第十四章),那么失调的位点就可能表现于不同类型的分化细胞中。举例来说，多组织间甲基化的高相关性(r=0.859) 就曾有文献记载。近期的研

第13章自闭症的表观遗传学——超越碱基的传递 223

究显示，甲基化的个体间差异在脑组织和血液间有显著的相关性，这提示任何获得性的甲基化改变可能在两者内都能探测到23]。与这一相关性一致的是，有多项研究在血液中定位到神经系统疾病基因区间上的甲基化变异位点24]。另外，还有研究指出，对于选定的大脑中组织，无论是整体,血液均可代替其用于区别ASD病例组和对照组。
然而这一发现价值不大，因为不论起源如何，组织总是由许多不同种类的细胞构成的，这样一来，一个由生物学样本反映的甲基化状态，就会代表出数千乃至上百万的不同种类细胞的平均甲基化状态。因此，CpG 甲基化中功能上相关的差异也许还不能被辨识出，因为它们散失于组织内其他类型细胞的甲基化状况中。然而，目前已开发的统计处理方法，可以从混合了不同细胞的血样本中，解析出同类细胞的甲基化状态【27,28]。

表观遗传与自闭症

多年以来，异常的表观遗传机制都被认为对 ASD 起很大的作用。以下列出的是选择一些综合征和有基因基础的例证，涉及可能会导致ASD 发生的机制。
MECP2

一个自闭症发病相关的表观遗传学机制已在甲基-DNA 结合蛋白 (MECP2) 上得到例证，后者是Rett 综合征的病因(MIM:312750) 。MECP2 在 ASD 的显著作用是基于Rett综合征和ASD 作为发育性障碍的共有病理基础，和MECP2 在 ASD 个体中的突变，尽管非常罕见30,31]。如 Gonzales 和LaSalle 综述所见，MECP2 是一个蛋白质家族的成员，这一家族的蛋白质特定地与甲基化的DNA结合并把它们功能化转录翻译为修饰过的基因表达。尽管被认为是一个分布广泛的基因转录抑制因子，另有模型提出MECP2 是一个转录调控器，经基因启动子外的远端甲基化位点进行核染色质结构的远程调节。功能上来说，79%的自闭症病例的额皮质中MECP2 表达减少，而与此疾病相关异常DNA甲基化表达增加[35。因此，MECP2 可能通过调控转录、促进组蛋白修饰，以及抑制转录因子结合、染色质循环和选择性 RNA 剪切等表观遗传机制来调节ASD。

FRAX
脆性X 染色体综合征(FXS) 是由染色体Xq27.3上的脆性X 智力障碍基因 1(FMR1) 上5'端未转录区域上的三核苷酸(CCG) 重复序列引起的。FMR1

224    表观遗传的，环境的和生理的因素对自闭症的影响

编码了被认为是将RNA 由细胞核转运至细胞质的蛋白(FMRP)³7], 并且可能参与了大脑皮质发育成熟383以及突触可塑性及认知的正常进程。 FXS 个体依据自闭症诊断标准[自闭症诊断观察量表(ADOS) 、自闭症诊断性访谈 (ADI) 和 DSM-IV]被认为可列入 ASD 谱系中，有趣的是，他们的ASD 风险是依赖于CCG 重复序列的数量的：正常(6～44个CCG 单位),过渡突变(44~ 54),前突变(55～200),或全突变(大于200)。基于上述，CCG 重复序列位于基因的启动子区域内的CGI, 序列的重复和DNA甲基化及组蛋白脱乙酰作用相伴随增长41,因转录因子NRF-1和 Sp1 不能转录42而导致FMR1 失去表达。然而，有个具有全突变的家族存在DNA 缺失和组蛋白的甲基化而没有呈现临床表型，可以看到含有CGG 重复序列的区域缺失，但并没有影响基因表达，这就强调了这样一个事实：基因区域的表观遗传修饰是至关重要的，尽管这并非 FMR1 表达的唯一驱动器。
安格尔曼/普拉德-威利综合征
基因组印迹区包含了被 DNA 甲基化以亲本依赖的方式调控的基因。根据双亲对抗假说。首先在人类中被描述的基因印迹疾病是遗传方式相反的普拉德-威利综合征(PWS)和安格尔曼综合征(AS) 。这两个综合征都与表观遗传调节异常或含在15q11-13 内的印迹控制区域的染色体重排相关联，有趣的是，两者都增加了 ASD 的发病风险。基因组间隔包含了父系表达基因，SNRPN 和 NDN,以及一个母系表达基因UBE3A。父系遗传基因的功能性缺失[染色体丢失、母系表观遗传型中类印迹控制区域内的甲基化增多与普拉德-威利综合征相关，该综合征特征症状为肌张力减低、肥胖和性腺机能减退。与之相反，安格尔曼综合征(特征症状为癫痫、震颤以及始终微笑的面部表情)是由UBE3A 缺失导致的，后者是因染色体丢失、基因突变、父系染色体UPD, 母系印迹区域甲基化缺失或母本UBE3A突变等印迹缺陷引起的。
15q11-13

基因组拷贝数,遗传连锁,且15号染色体上母系遗传的同形双着丝粒染色体增加了ASD 疾病风险。虽然15q11-13 区段上失调的表观遗传结果对于AS 和 PWS 发展的作

第13章自闭症的表观遗传学——超越碱基的传递 225
用是显而易见的，但这一区段内非印迹基因，如 GABAA受体亚基基因 (GABRB3、GABRA5和GABRG3)等，其类似机制效应尚不能明确。GABA基因编码了大脑主要抑制性神经递质的受体亚基γ氨基丁酸(GABA) 。在正常状态下，GABR 基因在大脑内是双等位表达的，然而，在神经细胞内GABRB3双等位优化表达过程中，可能扮演着染色质组织者角色的甲基 DNA 结合蛋白 MECP2,其缺陷将会导致患有ASD的个体大脑皮质中UBE3A 和 GABRB3的表达减少[36,553。
7号染色体
7号染色体上两个不同的区域，7q22.1到 7q22.2和 7q32.1 到 7q32.3,已与自闭症相关联54,且包含了需差异 DNA 甲基化来表达的印迹基因簇57]。这些离散的7号染色体基因位点作为可能导致亲源效应和性别差异效应的区域,与基因调控过程中的表观遗传机制相关联。ASD易感基因片段定位于7q32, 包含母系印迹MEST和非印迹的外被体蛋白复合物、亚基γ非(COPG2) 和中心体蛋白41kDa(CEP41), 而7号染色体簇也包括了两个父系表达的基因，编码了肌聚糖ε(SGCE) 和父系表达基因10(PEG10), 两者都被发现可与小鼠体内的MECP2 靶点[³3及人-鼠杂交体细胞内优先表达于父本染色体的对氧磷酶基因1(PON1)靶点[56相结合。
甲基化途径
如图13-2所示，DNA甲基化起始于S-腺苷甲硫氨酸(SAM) 提供的甲基添加至同型半胱氨酸-甲硫氨酸的再次甲基化过程中。甲基的来源取决于一碳单位代谢循环，由于这一循环，蛋氨酸的有效成分来源于不同的食源微量营养素，如维生素B₆、维生素 B₁₂、叶酸，以及酶类，如5-甲基四氢叶酸还原酶(MTH- FR), 这些在催化途径的关键阶段中是必需的。从逻辑上来说，如MTHFR等酶的功能减少，可能会引起甲基化不足，从而影响DNA、组蛋白和基因表达。因此，ASD个体中DNA变异引起的MTHFR功能破坏将遗传易感性DNA甲基化和饮食摄入紧密地联系起来，后者已被证明可导致不同 ASD 临床亚型之间的新陈代谢和遗传差异。

候补基因

随着DNA甲基化分析技术的改进(在后文讨论),在任一或两个等位基因上表现为差异性甲基化，且随不同组织类型空间变化或发育时间变化而变化的非印迹基因，其数量将继续增加。在整体层面，已有研究证明在ASD患病个

体内DNA的甲基化水平低，而调控特定基因表达的基因组区段内的过度甲基化也是一个可能与ASD相关联的表观遗传机制。以下列出的是几种较著名的、甲基化程度不同的ASD候补基因例证。
OXTR

催产素受体(OXTR) 的缺失先在一位ASD 患者身上发现，随后对其受影响的兄弟姐妹和父母进行 DNA甲基化筛查过程中，发现了CpG 二核苷酸对于 OXTR的很重要的调控作用。对位于两个无关ASD 组的每个个体筛查血液、皮质组织中的这5个CpG 二核苷酸，ASD 病例显示甲基化增高和OXTR 表达减低26]。催产素信号通路一直以来被认为在种属特异性地影响社会行为和认知功能方面，扮演着重要的亲社会角色62,63;然而，这些功能在脑功能和行为中有着性别二态性【64]。催产素信号的异常调控已被证明在高功能自闭症谱系障碍的发展中起重要作用和关联性研究证明催产素信号通路在 OXTR 导致的自闭症的病因学研究中起一定作用。最近，通过功能性核磁共振的方法发现了催产素受体基因的甲基化程度与感知有生命的物体引起的脑活动之间的关联。7]
SHANK3

SH3 和多锚蛋白重复序列结构域3基因(SHANK3) 是一种对于突触的形成、成熟和维持有重要作用的突触支架蛋白。SHANK3突变曾在一小部分ASD家庭中被发现72],因此这一基因被强烈认为很可能涉及ASD的病因学及神经病理学。最近的研究发现在小鼠大脑的 CpG 岛2附近的区域，有1/5的CGI中存在组织特异性甲基化，由此提示了 SHANK3 的表观遗传学调控作用。 SHANK3突变的小鼠已被证明可显示出自闭症样行为，包括社会交往障碍和重复性行为73。
颤蛋白
颤蛋白对于大脑及小脑皮质、海马回、杏仁核和数个脑干核团中的神经元迁移和突触发生至关重要74。与对照组相比，颤蛋白和mRNA 在自闭症个体大脑额叶和小脑区域内显著减少。类似于三核苷酸重复序列长度在FXS的因果关系，颤蛋白上5'端未转录区域内CGG/GCC 重复序列的长度也在遗传学角度与ASD相关联76,78]。不过，细胞系中颤蛋白依赖于长度的重复序列表达首先提示了基因的表观遗传调控。最近的研究证实，在表型正常个体的颞叶皮质中，颤蛋白的启动子甲基化水平在青春期前后有所变化80],而且，启动子区域的5-羟甲基化作用可能会影响 ASD个体小脑中MeCP2的结合和

第13章自闭症的表观遗传学——超越碱基的传递 227

随后的颤蛋白表达。
PRRT1和ZFP57
用以辨别不同DNA甲基化作用的高通量平台的出现，意味着多基因位点可以在成百上千的样本中同时被检测，而不用再进行依赖于演绎推理假说和单独的生物学证据对靶向候选基因进行甲基化检测。这里提到的基因是通过 ASD 组病例前额叶皮质、小脑和颞叶皮质的DNA甲基化模型与对照组进行特征比较来确定的，使用了基于SNP 的 CpG 微阵列(在后文讨论)。这些随后在复制数据库集中被验证的基因，是基于临近或包含在基因内的差异甲基化区域(DMR) 的位置而被确认的。
脯氨酸跨膜蛋白1(PPRT1)内的DMR 定位于基因的3'端未编码区，且公共结构域内重叠的表观遗传学数据支持了这个区域功能上的重要性。这一基因表现为合理的ASD候选基因，根据其表达的位置83,海马回在ASD中可能的作用84,853以及惊厥[86,871和运动障碍等神经系统病症，这些在以往都是与家族基因相关联的。
第二个基因，锌指蛋白57(ZFP57), 其 DMR 位于基因上游约3.5kb 处。 ZFP57 已被证实通过提供一个针对DNA甲基转移酶的机制⁹2],对于在发育过程中维持印迹标记有所帮助90,91]。这一机制的相关性已在上文中关于MeCP2在 ASD 发展中的重要性的部分阐述。

环境对表观遗传基因组的影响

正如前文所讨论的，表观遗传基因组是不稳定的，因此对环境影响较为敏感。那么这样的思考就很值得注意：这些环境暴露(在本书其他章节讨论)可能在胎儿发展过程中的重大转折期内介导了表观遗传学改变。
如 LaSalle₉3综述所见，有许多因素可影响 ASD 疾病风险，其中包括许多可能会影响甲基化谱变化的因素。如前所述，一碳单位代谢循环对于为DNA 甲基化提供蛋氨酸至关重要。为了减少神经管缺陷的数量，对这个循环最值得注意的操作是强化和补充叶酸；这也被证明对ASD具有保护作用⁹4,95]。
叶酸可能具有保护作用，但仍有许多危险因素可能会提升ASD疾病风险。尽管随逐渐增加的父亲⁹6、母亲⁹71、甚至祖父母年龄98而增加的疾病风险相关联的机制，很可能包括老龄父母的突变率率和遗传易感性,配子中甲基化的维持也有可能起一定作用100]。
常用抗癫痫药丙戊酸盐的宫内暴露已被确认是ASD 的危险因素。一般认为表观遗传机制是通过GABA介导的神经传递增强，和Wnt/B 连环蛋

228    表观遗传的，环境的和生理的因素对自闭症的影响

白及 ERK 信号系统的相互作用，以及修饰后的肌醇和花生四烯酸代谢来调节的。
如 LaSalle 综述所见。如前所述，患ASD的个体表现出全面的甲基化异常25,且这些毒素暴露与此全面的低甲基化水平改变和基因位点上靶向性高甲基化相关。但这些暴露不大可能是ASD的单纯病因，遗传易感区段内表观遗传影响可能也起一定作用。

辅助性生殖

围绕在辅助性生殖(如体外人工授精)领域中ASD 发展风险的提高，研究显示了一些相互矛盾的证据108]。在这些相矛盾的结果109,110]之下，总是会有关于队列大小、临床诊断和方法的议题。虽然可能没有确凿的流行病学证据证明其风险增加，有研究表明，小鼠的体外胎盘组织中的印迹基因上，可见随机表观遗传错误频率的增加11,且人类在体外受精或胞浆内精子注射后，印迹障碍更为普遍了112],不过其他研究并未发现类似的表观遗传学证据113。

DNA 甲基化分析的技术

随着微阵列的发展和基于新一代测序技术(NGS)的分析方法的出现， DNA甲基化分析正在经历着有几分类似于文艺复兴的过程。这些高通量处理方式的应用正在将 DNA甲基化分析的重点，由基于低吞吐量的技术的靶向性方法转变为无偏倚的发现方法，例如应用了基于微阵列的SNP 阵列的表观基因组关联研究(EWAS),以及应用了新一代基因测序平台的全DNA甲基化谱分析。
如 Laird 在其综述中所述115,低吞吐量技术，包括亚硫酸氢盐Sanger 测序法(依赖于未甲基化的胞嘧啶转换为胸腺嘧啶、而甲基化的胞嘧啶维持不变、并由PCR 和染色终止序列进行跟踪这一过程中的亚硫酸氢钠转换),同样应用重亚硫酸氢盐处理与监测核苷酸结合中磷的释放相协作方法的焦磷酸测序法，以及原始DNA内甲基化碳原子和非甲基化碳原子比例的质谱法测量。这些靶向性方法在确定那些已被指出有某种形式证据的基因组区域的甲基化状态时一直十分有效；而他们在未来的主要用途，将是作为一种已知与临床表型 (诸如神经发育性障碍或癌症等)相关联之基因位点的过筛工具，或者作为验证已被全基因组测序法(如微阵列或新一代基因测序平台)所确认的异常甲基

第13章自闭症的表观遗传学——超越碱基的传递 229

化位点的方法。
甲基-微阵列方法是一种引人注目的、介于靶向和全甲基化谱筛选方法之间的中间步骤。既相对便宜，其接近480000 CpG 二核苷酸的当前样本量、阵列质量控制的方法、标准以及数据分析和解释的方法又都相当符合标准。尽管受制于需从预测对基因调控较重要的基因组区位点中抽取一定数量的样本，这种方法已促进了涉及ASD的异常调控位点的发现82]。
如前文所讨论，人类基因组中有接近2800万CpG。到目前为止，通过靶向组织的DNA亚硫酸氢盐转换来检测一次全甲基化谱，并使用NGS平台完成序列，仍然是过于昂贵的。应该考虑到甲基化分析定量准确性是依赖于个体水平上 CpG 二核苷酸序列分析的覆盖深度的，而这实际上就等于你在核苷酸水平上去逐个数胞嘧啶或是经亚硫酸氢盐转换过的胸腺嘧啶所需要的次数一样。要记住，同质细胞的随机差异和异构“污染”的组织类型会干扰精确的表观遗传学析，3.2Gb 经亚硫酸氢盐转换的基因组的低水平覆盖是不够充分的。于是研究者们就面临着处理100倍覆盖的全甲基化谱，而这目前的费用是过高的。因此，如 Laird 所述¹15,从多种途径开发而提供一种方法，使得NGS能更经济地用于甲基化谱的定量测定，这些途径包括了针对80-100Mb基因组区域，通过诱饵-捕获来进行亚硫酸氢盐测序；使用可以“拆下”结构域蛋白上结合的甲基的抗体，通过免疫沉淀反应富集甲基化区域111;或者甲基化的DNA本身。
但是，应该注意的是，依赖对 CpG甲基化及随后的亚硫酸氢盐转换进行定量评估，无法区分5-甲基胞嘧啶和5-羟甲基胞嘧啶。尽管已有一个NGS 能够识别胞嘧啶的多种甲基化状态。

组蛋白和染色质修饰

除了DNA甲基化，基因表达还受许多染色质结构性修饰的影响。染色质的基本单位包括147个DNA 碱基对，缠绕着一个组蛋白八聚体；这个单位称为一个核小体(图13-1)。核小体结构使得整个基因组被压实在一个细胞的细胞核，并且调控进入DNA 的转录机。这种转录调控方式涉及翻译后，由酶特异性催化的组蛋白尾部共价修饰。最常见的修饰是乙酰化和甲基化，尽管还有许多其他修饰也可见，包括磷酸化、泛素化、类泛素化、瓜氨酸化以及二磷酸腺苷核糖基化。总体说来，乙酰化与DNA的可达性和转录活性的增长相关联，而去乙酰化则与转录抑制相关联；组蛋白甲基化可能与转录激活或是转录

抑制有关。这些修饰改变了组蛋白尾部的电荷，因此改变了与 DNA 之间的相互作用，促进了核小体的流动性和 DNA 可达性的改变。组蛋白修饰可能也通过核小体间相互作用来影响染色体高阶折叠。
翻译后的核心组蛋白修饰，包括乙酰化、磷酸化、甲基化和泛素化，与不同的染色质形态相关联。例如，H3 和 H4 尾端(H3ac,H4ac) 赖氨酸的乙酰化，H3上赖氨酸4的二甲基化和三甲基化(H3K4me2,H3K4me3),界定了具转录活性的染色质。H3K4me3 位于活跃基因的5’末端，而组蛋白H3 上赖氨酸36(H3K36me3) 的三甲基化也强烈标记了转录单位。两种修饰也都标记了非编码转录物126]。反之，H3 上赖氨酸9(H3K9me2,H3K9me3)的二甲基化和三甲基化以及赖氨酸27(H3K27me3) 的三甲基化与转录沉默染色质相关联122,127,128]。同一个氨基酸残基上不同的甲基化状态(单、二、三)区分了多种染色质结构域的功能和潜在功能性。 H3K4me2 与为转录而做好“准备”的染色质相关联，而H3K4me3 则与转录活性染色质相关联。组合的组蛋白修饰、同一组蛋白尾部或同一核小体内不同组蛋白尾部的多次修饰，产生了独特的染色质状态，并为一个基因组区域建立了表观遗传学特征或组蛋白密码(图13-4)。例如，H3K9me3 和 H3K27me3 都界定了小鼠和人类的不活跃X 染色质上的兼性染色质13,1371。

O 磷酸化
▶乙酰化
●甲基化(抑制) 鲁甲基化(活化)
●甲基化(精氨酸)
★泛素化

Adapted fron Allis 2006

图13-4组蛋白密码示意图

组蛋白和自闭症

尽管DNA甲基化是首个被证明在印迹基因的调控中有重要作用的机制，随后的将DNA甲基化与组蛋白修饰酶和染色质重塑复合体的相关联的研究

第13章自闭症的表观遗传学——超越碱基的传递 231
显示：表观遗传学标记的建立和维持需要多水平的染色质调控。数个存留在15q11-13内的父系印迹基因，包括 SNRPN、NDN、IPW、PWCR1 和 MAGEL2,并由父系染色体表达，而UBE3A则由母系染色体特异性表达。在人类中，SNRPN的启动子(15q11.2)已被证实富含H3和 H4 乙酰化，尽管其他间质内的印迹基因并未在任一亲代染色体上表现出这些修饰的显著富集140]。
在人类中，父代染色体上的PWS-IC 具有丰富的H3K4me2/3 和 H3/H4ac,而母代染色体上的 PWS-IC 则具富含抑制性的组蛋白修饰 H3K9me2/3 和4K20me3。反过来，母代染色体上的AS-IC 则富含H4ac 和H3K4me2/3,但没有H3 乙酰化[126。

未来方向

很显然，DNA序列，无论是碱基突变/多态性还是染色体丢失/增加，并不能完全地解释影响ASD 发展的遗传可能性和环境潜在影响。日益增多的证据表明，以异常的DNA甲基化和/或组蛋白修饰的形式出现的表观遗传机制可能起一定的作用。然而，ASD 研究的表观遗传学领域面临许多的挑战，这些挑战需要解释如下的问题。首先，病例组和对照组之间表观遗传状态的差异是否与功能有关?也就是说，它们会通过mRNA 和蛋白质表达转化为明显的差异吗?第二，改变了的表观遗传模式是否是表型的驱动者，还是说这些表观遗传改变只不过是某些其他发病机制的结果?建立因果推论将是非常重要的。此外还有一些问题：我们怎样才能确定哪些细胞是ASD的标记，我们如何克服组织的异质性，以及随机事件会否妨碍单细胞表观遗传分析的有效性?最后，我们的流行病学理解要多么深入，才能在环境暴露、母系暴露以及子宫内表观基因组之间建立因果联系呢?
还好，今后还是有一些令人激动的机会的。与归责原则类似，许多可用于延展信息的方法正在被开发出来，这些信息可能来自通过甲基化CpG 归责的微阵列平台；DNA 和组蛋白的表观遗传分析的分辨率及吞吐量都在改善；分析如 5hmC 等修饰的新方法正在被开发。当我们得到这些数据时，我们也要意识到，表观基因组并非孤立地发挥功能。这一ASD研究领域将会迎接挑战，去解释失调的表观基因组如何通过系统性方式影响转录组、蛋白质组和代谢组，从而找到ASD的病因和治疗方法。

本章要点

● DNA甲基化：一种通过将化学基团连接至DNA 骨架上来调控基因表达的

232    表观遗传的，环境的和生理的因素对自闭症的影响

机制。
● DNA甲基化的调控作用：DNA 的高/低甲基化能够调控基因表达。
●表观遗传学和自闭症：一些导致自闭症的机制，但不改变DNA 序列。
●候选基因：可能在自闭症的发展中起一定作用的表观调控的基因。
●环境对表观基因组的影响：影响到表观基因组的环境变化可能会导致 ASD。
●辅助生殖：体外生殖的过程，可能会影响表观基因组。
●DNA甲基化分析技术：分析生物学样本表观基因组的平台。
● 组蛋白和染色质修饰：组蛋白N 端结构域上，可影响基因功能的化学修饰。
●组蛋白和自闭症：组蛋白修饰可能在ASD 发展中起一定作用。

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第14章

自闭症谱系障碍的基因与环境因素：一个整合的视角

Kelly M.Bakulski,Alison B.Singer,M.Daniele Fallin
周洋译，陈一心孔学君校

摘要
自闭症谱系障碍(ASD) 是一组以沟通和社会交往障碍以及重复性行为为主要表现的神经发育性障碍。ASD具有高度遗传相关性，但环境的影响可能也会导致疾病风险。迄今为止，仅有少数特定基因或环境因素被确定地描述。 ASD病因学的基因和环境研究通常是分别进行的，而不是将基因与环境因素结合起来开展研究。这一章节提供了同时支持基因和环境病因学的证据，并提出了如何整合这两个领域并向前推进、凸显潜在的收益，以及如何应对特别挑战的建议。
关键词：环境；遗传学；表观遗传学；甲基化；相互作用。

ASD 的病因学模型——基因，环境，还是两者皆有?

自闭症谱系障碍(ASD) 是一组复杂的神经发育性障碍，以沟通、社交能力的缺陷和重复性行为为主要特征。根据自闭症和神经发育性障碍监控 (ADDM)网络最近的研究报道，2008年全美8岁儿童中，ASD 患病率约为 1/88↓,性别比接近4:12]。引起性别差异的机制目前尚不明确³。目前， ASD没有治愈手段或基本预防策略，最终这将需要对ASD病因学进行全面的了解。这一章介绍了有关ASD病因学的遗传及环境因素的现有证据(图14- 1)。我们认为ASD的疾病风险可能是遗传和环境因素的结合，并阐述了基因与环境(GxE) 交互作用的潜在机制，以及ASD 研究可以怎样来构建问题，以整合这些假说。

第14章自闭症谱系障碍的基因与环境因素：一个整合的视角    243

图14- 1孤独症谱系障碍(ASD) 疾病风险的示意图，包括独立的遗传学因
素、独立的环境

遗传证据

双胞胎研究是评价基因和环境对疾病影响度的强有力实验设计4]。具有相同遗传物质的同卵(MZ) 双胞胎和半数遗传物质相同的异卵双胞胎(DZ) 之间的一致性比较，可以用于计算疾病的遗传可能性。举例来说，一项美国的双胞胎研究提示了ASD的高遗传可能性：MZ的一致性是88%,而DC的一致性是31%⁵。这项研究以及其他双胞胎研究均提示 ASD 的高度遗传可能性[⁶,7,并引发了大规模的 ASD 遗传学调查；但如后文所述，许多这些基因研究的结果都显示了遗传风险因素并没有遗传继承性，且尚不能完全解释这一高度遗传可能性。
相对于以往的认识而言，近来更多的双胞胎研究提示，处于相同环境也可以显现ASDs中更高百分比的变异性。在加州生长发育服务部的一项研究中， MZ双胞胎一致性为58%,而DZ 的一致性是21%8]。由这些数据可知，环境因素在变异性中占58%的作用，而遗传可能性则仅占38%。同样，在瑞典的双胞胎注册系统中，MZ双胞胎的一致性为47%而DZ 双胞胎为14%。这项研究显示遗传学效应在ASD的变异性中占80%的作用，而另外20%则归于环境。重要的是，最新的双胞胎研究提供了ASD遗传组分风险因素的证据，也强调了遗传因素在ASD病因学中的作用，但是低估了环境因素在自闭症发病中

244                表观遗传的，环境的和生理的因素对自闭症的影响的作用。
ASD 的遗传与环境病因学的历史展望
紧随首个ASD 双胞胎一致性对照研究。基因障碍苯丙酮尿症(PKU) 及 ASD的共现性提示了较小规模的遗传失调也出现于ASD¹4]。根据4:1的男女性别比例，X 染色体的作用也被给予了特别的关注。脆性X 综合征，由脆性X精神发育迟滞(FMR1) 基因上的三核苷酸重复序列(CGG) 引起，也在许多 ASD病例中被观察到15]。早期的研究显示，接近30%的脆性X 综合征病例与 ASD共同发生。不过，从扩展的家系图谱看，由男性到男性的传递似乎与X 连锁假说相矛盾。总体说来，早期ASD遗传学研究，包括对常染色体的研究，结果是多基因的协同作用，这个结论在各项研究中并不一致。而现代技术的进步，已经能够实现全基因组测序，这将有希望通过研究而发现遗传病因。
在这些重要遗传学研究开展的同时，广泛的病例报道提示了暴露引起的先天性障碍和ASD 的共现性。根据病例报道和小型临床研究，与ASD相关的化学及生物学制剂，通常与母孕期的母亲的暴露有关，包括丙戊酸以及疱疹病毒³4]。这些研究提供了非遗传因素可能会影响 ASD 的发展的循证依据，并建立了近年来更多流行病学的或人群的ASD危险因素研究的基础。
在接下来的段落，我们将讨论现有的有关ASD 的遗传与环境危险因素的知识体系。我们还将讨论在自闭症的流行病学研究中，将遗传和环境例证结合起来考虑的重要性。后面会谈到当前面临的挑战，以及对这一发展中的研究领域的未来展望。

ASD 的遗传危险因素

ASD的遗传学领域在近十年来呈爆炸式发展，多项综述总结了目前的进展。与ASD 相关的基因变异类型可归类为：遗传的，即亲代传至子代；或新生突变的，即在后代中出现了自发的基因改变。新生突变显然很罕见(出现频率远少于1%),而遗传的可能罕见也可能常见(通常>1%)。

第14章自闭症谱系障碍的基因与环境因素：一个整合的视角 245

ASD 的遗传基因
基于ASD的高遗传可能性，对发现能够解释这一障碍的遗传变异体是很有希望的。全基因组研究(GWAS)已经通过家族研究和病例对照研究检测了人类基因组常见的单核苷酸多态性(SNPs) 。这些常见遗传变异体的研究已确定了染色体5p14.1³9] 、5p15.240 和 CNTNAP2基因41]的相关作用，尽管复制样本很难，但是对这些罕见变异体的研究吸引了更多注意。这些GWAS SNP 套餐也可进行变异拷贝数的检测，在同一个体中超过或低于2个设定序列的拷贝将被检测到，比如缺失或重复。常见的CNV 已被证实与ASD 相关联，这里值得注意的是在神经连接蛋白NLGN1基因，这个基因编码了一个神经细胞表面蛋白42]。
现代测序技术也能够在ASD 病例中检测罕见CNV 和罕见的单核苷酸变异(SNV) 。几个罕见遗传性SNV已经与ASD相关联，定位于生物学上可信的基因内。在这些同类基因中的一部分中，已经观察到了罕见的CNV 的存在。总之，多项研究一致发现ASD 儿童基因组中罕见的 CNV 逐渐增长，尤其是那些交叉基因46],尽管可遗传的拷贝数变异(CNV)以及相关基因的具体位置缺乏一致性。
ASD 中新生突变的基因改变
许多ASD遗传学的研究发现与新生突变的或者说不是从父母遗传的SNV 和 CNV 有关。最近的一项研究显示，在46%的ASD 病例中观察到了新生突变的错义和无义的编码，这些位点上富集了ASD 相关的基因47]。在一项检测兄弟姐妹差异的研究中。一项类似的研究显示，病例中SNV 位点富集了与智力障碍和迟缓相关联的基因50]。综上，这一证据提示罕见的SNV 和 CNV 新生突变与ASD有关，虽然识别特定基因关联还是比较困难的。含有ASD 相关 CNV 新生突变的特定基因区域，包括了16p11.2 的缺失和重复，这已在多项研究中被重复验证，且根据几个研究报道，16p11.2的缺失和重复只出现在少于1%的病例中

遗传学总结

尽管全基因组的研究数量巨大，到目前为止，遗传的和新生突变的基因变

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异还不能解释大部分ASD病例，况且，异质性是显而易见的。确定可以引起较大的影响的单个基因是很困难的，可能是由于ASD疾病风险的多基因性质和环境因素的潜在影响。建立特定基因变体的因果关系，尤其是那些罕见的基因变体，已被证实非常困难，ASD 新生突变的主要研究提示了亲代或祖代、环境或年龄可能是比较接近的原因。完整的、不断更新的ASD 相关遗传风险因素及其证据，可在 Simons 基金会自闭症研究计划基因库2 .0网站(https:// gene.sfari.org)上查询。

ASD 的环境风险因素

鉴于遗传学背景似乎只能解释一部分 ASD 的病因，而环境危险因素多年来一直被认为与影响神经发育过程有关54,55,现在越来越多的研究开始关注于检测ASD的潜在环境危险因素。下面我们将讨论与引发ASD 风险的特定环境压力最为相关的发育易感性窗口期。在这一综述中，我们将广泛地定义环境危险因素，包括讨论父母的一些特征和毒物的暴露。
易感性窗口期
目前搜集到的证据提示，产前期是非常重要ASD易感性窗口期。例如，自闭症儿童大脑的神经解剖学检测研究显示，自闭症儿童大脑中浦肯野细胞数量减少，但下橄榄核中的细胞数量并未减少。Bauman 和 Kemper⁵ 提出，鉴于橄榄核神经元和浦肯野细胞之间的连接发生于妊娠28～30周，浦肯野细胞的损害肯定在此之前发生。脑干异常也在一些病例中被描述了，这意味着这一障碍的起源可能发生于神经管闭合时期。另外，一些关键期的致畸原也可能与ASD 疾病风险相关，比如孕早期接触沙利度胺26,60J。一些患ASD 的儿童表现出行为上的异样61 和在出生后第一年大脑的加速发育[62-64,这些事实提示，易感性窗口期是产前期或出生后早期。最后，在产前期暴露于化学物质已被证实与脑影像学异常[65和神经发育结果55,66相关。
父母特征
许多研究报道了高龄双亲与ASD 之间的关联，尽管有关其是由母亲年龄还是父亲年龄所引起，又或是两者皆有的争论仍然存在[67-86】。有关这一双亲年龄风险的机制，研究者提出了许多理论，包括不断增加的毒物的累积、母亲子宫内环境的改变、使用辅助生殖技术具有的更大可能性，以及随着双亲年龄增长，新生突变和表观遗传修饰的比率会更高。
双亲身体状况也被认为有一定关联，它可能反映了不同疾病的共同遗传

第14章自闭症谱系障碍的基因与环境因素：一个整合的视角    247

易感性，也可能反映了可影响儿童发展的子宫内环境改变，还可能反映了仔细随访的父母本身可能具备特定类型的疾病状况。特定类型的疾病状况包括父母精神健康状况史,母孕期代谢状况9](2型糖尿病、妊娠期糖尿病、高血压、肥胖),以及母亲的过敏和自身免疫疾病95](包括类风湿性关节炎和妊娠期间的哮喘和过敏(⁹5)状况。不过，这些母系免疫关联尚未有一致性研究结论。最后，一篇关于不孕症治疗和 ASD的荟萃分析在已有研究中发现了不一致的结论⁹8。
一组与不良分娩结局相关的分娩并发症，包括异常分娩、低出生体重、小于胎龄儿、低Apgar 评分以及产妇出血，都与ASD 相关99】。然而，似乎没有哪一单个因素可以解释这一关联，现有的解释认为，ASD 和分娩并发症的共现性基于一个共同的原因。有两项研究将两次妊娠之间时间间隔的增加与自闭症患病概率的减少相关联。这一理论与近期一些流行病学文献将妊娠前及妊娠早期的孕期维生素[102,103和叶酸[103,104摄入量，与ASD相关联的结论相符。
毒物

有关父母的特征和ASD的文献越来越多，但少有流行病学关于环境毒物对 ASD 发展潜在影响的研究，尽管病例报告和其自圆其说的生物学机制提供了早期证据。以往由于受样本量较小和评估暴露风险的方法不精确的限制，有关环境毒物引起相对罕见ASD等病症的前瞻性研究较为欠缺。在接下来的段落中，我们将讨论有关ASD的化学和生物学毒物危险因素的现有知识，以及如何拓展这一领域。
化学毒物

化学毒物可以被按照暴露类型来分类：行为型，环境型，职业型和药物型。
行为型：父母吸烟与ASD风险之间关联的研究结论是很不一致的：一些研究结论提示反向关联105],一些研究结论提示正向关联,还有一些研究无结论。产前酒精暴露和胎儿酒精综合征可能会引起自闭症样症状[109,-11;但目前尚缺乏关注胎儿酒精暴露风险和ASD 的流行病学研究资料。
环境型：人群通常会以低水平暴露于无处不在的化学物质，包括金属、多氯联苯(PCB)、有机磷农药、DDT、乙醇以及多溴联苯醚(PEBDE), 在动物和人

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类研究中[54,55,112,113,这些化学物质均涉及神经发育的异常，但目前几乎没有关于毒物暴露和 ASD 疾病风险的研究发表，尽管这一领域越来越受关注。
由于空气污染，分娩时，母亲的住所邻近高速公路(309米之内)与ASD 风险升高有关1¹4]。特殊的空气污染混合物如氯化溶剂115]、二氯甲烷、柴油116和二氧化氮118],每一种都与 ASD 相关。但是这些关联在不同研究中结论并不一致，可能是由于病例组和对照组定义不同，潜在混杂因素的变量处理方法不同，或是多个检测问题中关注点的不同。进一步讲，基于空气监测站的数据建模，有毒物质排放内容，或是农药应用程序数据库的暴露风险评估，缺乏个体监测精度。
孕期胎儿中枢神经系统发育过程(妊娠前7天至妊娠期49天)中暴露于有机氯农药已被证实与 ASD 相关119]。脐带血中毒死蜱的水平120和妊娠期母亲尿液中有机磷农药产物的含量也与广泛性发育障碍(PPD)相关。这些研究均提示农药暴露与ASD之间有关联，但存在着样本量小、诊断分类广以及临床验证有限的局限性。未来的ASD 环境流行病学研究应该用更精确的 ASD 诊断分类，在合适的时间窗内对这些暴露因素进行单独测量评估。
职业型：迄今为止，仅有2篇已发表文献关注双亲职业暴露风险对ASD的影响，通过职业史来评估工作环境暴露风险，后者常常比一般性的环境暴露风险要高。与对照组中正常发育儿童的母亲相比，患儿的母亲更可能是从事一些有化学物质暴露风险的工作。当那些母亲的职业暴露因素是消毒水、废气和燃烧产物时，与ASD尤为相关122]。与正常发育的对照组相比，ASD病例组中双亲职业暴露因素为沥青和化学溶剂的比率较高，但在多重比较调整后，这些关联并无统计学意义。需要更多的研究来探究这些结论是否能在不同的研究对象中被重复出来，或者是否有其他可能与ASD 相关的职业暴露因素。
药物型：目前的流行病学研究发现，母亲在妊娠期间服用抗抑郁药物的儿童，ASD患病风险更高,一项研究特别指明是选择性5-羟色胺受体摄取抑制剂(SSRI)类药物¹²4。至少两项研究确认了ASD 疾病风险和妊娠期使用作用于β-2肾上腺素能受体系统的药物之间的关联，例如特布他林，一种用于哮喘的药，同时也在妊娠过程中起宫缩抑制剂(分娩抑制剂)的作用;不过这些研究结论大部分并无统计学意义。丙戊酸钠，一种抗癫痫药，在妊娠期间的使用也与ASD 相关127】。对于这些研究发现，主要的批评意见是，母亲身体的基础状况和服用这些药物的原因，相比药物暴露本身，更可能导致这些关联，并且可能缺乏校正这一问题的尝试。需要更多的研究来验证这些双亲药物暴露确实是ASD 的危险因素。

第14章自闭症谱系障碍的基因与环境因素：一个整合的视角 249

生物性毒物

如前所述，有病例报告将先天性感染与ASD 相关联起来。动物研究也证明，母体感染会影响后代的神经发育结果。进一步讲，自闭症儿童可能有免疫功能异常。将妊娠期母体免疫活动与ASD 相关联的流行病学证据在很大程度上是相互冲突的。一项2009年的荟萃分析显示，当纳入11个研究时，并未发现妊娠期感染与自闭症的总体关联性¹²8。但当仅纳入4个控制了潜在混杂因素，或应用了同胞对照组的研究时，母体感染和ASD 之间就观察到了具有统计学意义的关联,尽管观察到了一些妊娠特异性关联。流行性感冒或发热与自闭症的关系是混合性的31,130,132]。许多因素，包括对照组定义的不同，以及收集暴露因子方法的不同(例如自我报告与住院后行政性收集)使得这些研究之间的相互比较十分困难。根据现有的来自动物模型的生物学证据，与来自流行病学文献的混合性报告，孕期母体感染对 ASD的潜在影响需要更多的调查和研究来证实。

基因与环境结合的风险范式

很显然，基因与环境因素都增加了ASD的疾病风险。通过双胞胎研究，我们得知ASD是一类高遗传可能性的疾病，但现有的遗传关联性研究无法解释其中大部分的遗传可能性。关于这一遗传性缺失，一种可能的解释是，大部分的 ASD 遗传风险取决于环境因素(以往研究并未考虑到这一点)。可能存在未被识别的遗传和环境的边际效应，或者基因与环境之间可能有直接的相互作用。以下的部分将讨论可以从基因-环境交互作用研究中得到的观点，以及为什么这是一个非常有前景的ASD 研究领域。
基因-环境交互作用的潜在应用
在公共卫生领域，基因与环境的联合考虑以及它们的交互作用(GxE)可以发挥极大的作用。例如，吸烟已经被确定是肺癌的危险因素，尽管并非所有的吸烟者都会患上肺癌；而肺癌的疾病进展在吸烟者中的异质性可归因于基因型。虽然 ASD的 GxE 研究尚在起步阶段，但 GxE 研究还是可以帮助理解神经毒性和神经发育。 GxE 研究可以用于探讨各种各样的流行病学问题，从鉴别和描述疾病的遗传学效应，到暴露因素和疾病之间关系的机制，还可以将临床治疗和公共卫生预防个体化。

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首先，考虑到交互作用可以提高侦测到小信号基因的能力137-139],GxE 研究在全基因组研究(GWAS) 中可以用于识别和区分在典型的边缘检测中由于背景噪声而难以找到的遗传效应136]。同样地，如果一个基因已在GWAS中被确认与疾病有关系了，GxE 研究可以在环境暴露水平上帮助描述这一遗传学效应的性质16]。这样，ASD的 GxE 研究也许能确认与疾病相关的新的基因位点，也许还能阐明已知的遗传风险与取决于暴露因素的ASD 之间的关系。
GxE研究的另一个关键作用在于，在暴露因素和疾病之间提供了机理性的认识。环境流行病学研究常常受制于回顾性暴露评估，以及无法明确确定暴露与疾病之间的因果关系。GxE 研究还可以用于检测暴露与疾病之间的功能性关系140]。如果一个已知的生物学路径是用来处理一种毒物，或将毒物与疾病机制关联起来，研究者就可以沿着影响生物转化或疾病表现的路径来确定基因型。如果基因型影响了暴露与疾病的关联，暴露与疾病的关联性质就更为可靠了。进一步讲，GxE 特征性描述可以帮助从复杂的暴露因素复合体中确定有影响的组分，如膳食、空气污染以及吸烟140]。在ASD 病例中，GxE 研究将会有助于区分ASD的简单和复杂暴露因素。GxE 研究还可能对广泛的公共卫生领域产生影响，并且能够帮助推动疾病治疗和预防的个体化。与根据遗传背景，对个体进行的药物治疗的反应研究的临床药物基因组学类似， GxE 研究也可以带动疾病预防的个体化。这种观点很有前景，但尚不能确定遗传学在未来是否能够预测个体对混合型暴露因素的反应。更可能的是，这一研究将能够帮助识别可能因暴露增加了疾病风险的易感人群。易感人群的低响应阈值可能会影响与人群可接受风险水平相关的环境立法。GxE 研究的公共卫生相关性将取决于效应的强度、人群中暴露的水平以及人群中的等位基因频率。对于ASD,GxE 研究可以帮助识别有患病风险的个体，或许我们还能够通过在这些敏感群体中消除暴露因素，来积极预防或减少疾病严重程度。总而言之，这些例子阐明了GxE 研究在科研与临床观察中的广泛应用，以及这项研究对于ASD的必要性。
GxE 机制
基因和环境因素相互作用提高疾病风险，有许多种可能的机制。统计学家及生物化学家对于GxE 交互作用的本质有着相当不同的概念：前者将交互作用描述为背离了某种特定的统计模型；而后者则侧重于细胞成分或分子标靶之间的生物学相互作用，它可能会导致基于模型的统计学交互作用，也可能不会。下一段落我们将参考GxE 研究文献，描述这两种 GxE 机制类型，并举例说明。

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统计学和流行病学交互作用

从流行病学的角度看交互作用的概念是来自于这样一个设想：一个暴露因素的影响力，随另一个暴露因素的出现或消失而变化。至于GxE 交互作用，我们提出了3种机制假设：①暴露因素对疾病的影响被遗传背景修饰；②遗传变异性的影响被环境修饰；③仅基因和环境结合的协同作用本身已经足够导致疾病(图14-2)。

图14-2孤独谱系障碍(ASD) 基因-环境交互作用的4个机制：
遗传修饰的暴露因素影响(A),环境修饰的遗传影响(B),基因
和环境的联合影响(C),被环境调控的遗传影响(D)

首个流行病学研究中的GxE 交互作用模型涉及一个依赖于基因型的暴露因素与疾病的关系[图14-2(A)] 。例如，孕期的低叶酸摄入量对神经管缺陷 (NTD) 风险的影响，是被影响叶酸代谢的一碳单位代谢路径的基因多态性调节的，包括 MTHFR,MTHFD1,MTR,MTRR和 RFC-1。不过在这个例子中，低叶酸风险的母体效应是可以被观察到的，这个范式非常有助于了解基因易感性与在儿童身上表现出的结果，特别是当母体效应不足够强，并且风险效应只能在考虑了遗传易感性之后才能被观察到的时候。这个遗传易感性调控暴露对疾病的影响的原则，在哮喘、心血管疾病以及癌症的流行病学文献中也是明确的[142-1491
被暴露因素修饰的遗传效应表达结果在理论上也是可能存在的[图14-2 (B)] 。有害的基因型可以导致疾病，但疾病表现型的严重程度可能是被变异

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基因产物的表达控制的。于是影响基因的表达或有害蛋白质的有效性的暴露因素，就会修饰疾病风险因素。目前还有一些这一模型的直接例证，印迹障碍也可以说明这一点。例如，天使综合征是由一个特定基因(UBE3A) 的遗传变异导致的，但这一综合征的发展取决于双亲的原始突变。在通常情况下，人脑中 UBE3A的父本等位基因被DNA甲基化而沉默，而母本等位基因被表达。这样一来，这个综合征只在变异遗传自母亲时产生，表观遗传机制促进了这一表达结果。遗传自父亲的变异是无关紧要的。因此，不论遗传变异是否与疾病相关联，基因组的表观遗传学“环境”都影响了疾病的发生。最后一个GxE概念模型的流行病学交互作用需要基因与环境在疾病中表现为协同效应[图 14-2(C)] 。例如，苯丙酮尿症(PKU) 患者的苯丙氨酸羟化酶基因(PAH) 发生了变异，阻碍了苯丙氨酸转化为酪氨酸。由食物中获取的苯丙氨酸累积并影响了大脑的发育。这一疾病的症状可以通过低苯丙氨酸饮食来避免。因此， PAH 基因的变异以及苯丙氨酸暴露，两者需要相结合才能够导致疾病。
环境影响的基因修饰模型，遗传效应影响的环境修饰模型，以及环境与遗传协同效应模型，这些模型之间的分析结果显示出了统计学差异。研究如何构建模型，很大程度上是根据概念框架和系统中因果关系理论来选择的。关于暴露因素和基因产物间的相互作用，生物学研究可提供两者之间因果关系的证据。
生物学交互作用与分子标靶

关于GxE 交互作用，另有一些观点聚焦于交互作用的分子生物学研究。暴露因素与遗传学或基因产物在细胞内交互运作的机制有很多。毒物或毒物代谢产物的产生可能直接与 DNA 序列或DNA 表观遗传修饰相关[图14-2 (D)] 。暴露因素或其副产物也可能会直接对基因产物(蛋白质)产生影响。目前尚未完全查明大多数暴露因素的毒性作用机制，不过我们总结了少数文献中提到的生物学GxE 交互作用的例子。
DNA序列的直接损害是许多已被透彻研究的毒物作用的重要机制，这些毒物常常也是致癌物质。这些物质在遗传损害和疾病风险中表现出了剂量正向相关性。比如在健康个体中，二噁英暴露会引起与淋巴细胞中t(14: 18)易位有关的非霍奇金淋巴瘤的基因低拷贝数，以及t(14:18) 阳性细胞数的增加。另外，电离辐射，比如在切尔诺贝利和福岛核事故中产生的辐射，导致了基因组的不稳定性和下一代生殖细胞的DNA 突变155】。总之，新生突变的遗传变异可以由暴露因素引起，而这些变异则可以导致疾病，这使得基因成为暴露风险的直接介质。环境表观遗传学是研究的新兴领域，主要关注不影响基本DNA序列、但能够引起基因表达的遗传性改变的暴露因素。表观遗传

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学改变，包括DNA甲基化、染色质修饰以及某些类型的RNA。许多环境暴露因素能够引发整体或基因特异性模式的表观遗传学改变156]。表观遗传学对暴露因素的应答是不统一的，并且遗传因素可以修饰表观遗传学对环境的应答。表观遗传学机制已被证实与ASD 有关，这是一个尤其有前途的ASD 疾病风险与发展的GxE 研究领域。
毒物和代谢产物也可以直接与细胞蛋白质相互作用。例如，重金属铅可以影响蛋白质在体内的摄取(DMT1) 或转运(转铁蛋白),因此这些蛋白质的特定亚型，作为遗传多态性的结果，可能会导致对铅的不同生物学反应和后果161,162]。另一个例子涉及血红蛋白，血红蛋白是血液中携带氧的分子。高铁血红蛋白血症是一种血液疾病，该疾病可产生一种异常类型的不能释放氧的血红蛋白。这个疾病可能由硝酸盐暴露引起，常来自于有饮用水源流过的农田，或可能由高铁血红蛋白还原酶的基因多态性引起。硝酸盐被摄入后，转化为亚硝酸盐，亚硝酸盐可与高铁血红蛋白结合1631。硝酸盐暴露对高铁血红蛋白的影响水平是由高铁血红蛋白还原酶的多态性调节的。在这些例子中，毒理学证据表现出功能性生物学关联，证明了统计学上的相关性。
目前的GxE 自闭症流行病学研究
许多神经功能损害，从神经系统结构的发展，到儿童和青少年神经发育障碍，以及神经退行性疾病，这些疾病中都存在基因和暴露因素的交互作用。除了前文提到的，神经管缺陷中低叶酸和遗传易感性的交互作用16以外，由智力发育指数(MDI) 评价的儿童认知发展，可被有机磷农药暴露和对氧磷酶1 (PON1) 基因的交互作用破坏[167。
到目前为止，有3篇有关自闭症的研究报道了GxE 结论，其中2篇是关于母体营养和涉及叶酸代谢的基因多态性之间交互作用引起的疾病风险。总体来说，母亲在怀孕前3个月和妊娠第1个月摄入孕期维生素，孩子出生后被诊断为自闭症的可能性就相对不高，这一情况在携带涉及一碳单位代谢途径(MTHFR 677T和 CBS rs234715 GT+TT)功能的变异体的母亲中更为明显。同一研究显示，妊娠第1个月叶酸摄入量≥600μg/d (美国食品与药品监督管理局推荐的日常供给量)是ASD的保护因素,但这一效应是被母体携带的特定MTHFR 基因型诱发的。这项研究为叶酸与ASD 之间的作用提供了一个机制，并发现了一个对叶酸摄入量特异性敏感的人群。第3项GxE 研究报道了交通导致的空气污染暴露与妊娠和 MET 基因型之间的交互作用。如果母亲在妊娠期间居住在交通空气污染较高的地方，MET 启动子CC 基因型的rs1858830 纯合子儿童，具有很高的 ASD 患病风险，高于其他类型的暴露/基因型结合作用168]。

整合途径的挑战与建议

遗传措施
目前的基因组测量技术呈爆炸式发展，关于研究哪个方面的“遗传学”,我们有很多选择。早期的遗传学研究只能聚焦于某些候补基因，这些研究局限于当时有限的生物学知识和该基因在商业平台上或通过分类基因标记的直接基因的可用覆盖率。目前的候选基因研究对于生物学更加了解，并且通过多 SNP 基因型和基因测序，分别可以使常见变异和罕见变异的检测达到相当高的覆盖率。今后的研究还可以采取一个诊断性全基因组的方法来使用全基因组或全外显子组SNP 基因位点阵列或测序。在这些方法中进行选择，取决于对数据深度、检测花费、时间的要求，和运算/分析的能力。全基因组基因分型还可能会导致一些无法估计的隐私和伦理后果。发现导向的GxE 平台也将需要考虑到相对于研究样本量大小的额外比较数。
关于应该去测量谁的基因组的问题也很重要，从GxE 角度考虑，如果ASD 病因起源于子宫内，那么母体基因型可能和儿童基因型具有同样的相关性。每项研究都将会需要确定，对母亲和后代均进行基因检测，是否可行或必要。这个特殊的问题已经在关于孕期维生素和叶酸摄入量以及MTHFR C677T 基因的研究[102,103中被探索过。
暴露评估
从许多方面来说，暴露的评估和分析相对于基因分型，是一个更复杂的尝试。暴露评估的时间点和误分类的可能性，与遗传的检测相比，是更为重要的议题。尤其是在环境风险因素效应量较小的研究中，误分类可能会影响研究观察。对于ASD研究来说，病例对照和病例家庭研究比前瞻性群组设计更为常见，因为自闭症患病率较低，使得队列研究效率低且非常昂贵。这在暴露因素时间评估方面尤成问题，特别是考虑到围产期易感性时间窗是相关性最大的。回顾性暴露评估是非常困难的，因为大多数暴露因素，以及来自妊娠期或生命早期的生物学或环境样本都在2～10年后无法获得了。因此，ASD 风险因素的暴露评估流行病学研究通常是依赖于问卷自我报告和健康管理记录的。这两种风险分类的方法都提出了具体的挑战。当风险信息通过病例情况确定后的问卷调查来收集时，ASD 患者的父母可能会与对照组父母不同地回顾产前期，可能对研究结论产生偏倚。健康管理和职业记录，虽然能够提供有关病例组和对照组风险的无偏倚的信息，但可能欠缺细节或精确性。

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当个体的生物学样本能够获取时，生物标记测量是首选的风险评估方法。但是一种有关毒物生物学机制的理解，需要被纳入分析。人体可以将大多数毒物进行有效的生物转换和运输。当在临床上确定一个疾病或健康诊断时，潜在的风险可能早已被排出体外。因此，特别是对于相对生物学半衰期短的风险因素，在精神发育相关时间窗、疾病确诊前以及疾病进程中选择生物学样本，或是选择可能不会被原始毒物消除的持续性的生物学标记，都是非常重要的。生物标记测量或环境取样都为风险评估提供了一些优势，但依赖于在妊娠期的重要时间点去收集样本。就像遗传学研究由候选基因研究发展到全基因组分析一样，环境流行病学研究范式可能会由候补风险转变至考虑到一个人全部的“风险组”。全方位环境研究，可以使我们全面考虑每天遇到的复杂混合物之间的交互作用。
表型评估
ASD没有明确的检测方法；诊断都是基于临床评估，诊断标准都是基于观察和访谈获知的信息。因此，测量误差是ASD研究的一个主要局限性。此外， ASD是一组有不同致病因素的障碍。解析 ASD 相关的特征或与组分，也许可以减少测量误差并提高特异性症状的特定因果关系的可检测尺度。在GxE 背景中，所有通过减少错误和/或提高精确的因果路径而获得更高统计效率，是必需的。而进一步的提高，可以通过考虑定量的“内表现型”获得，后者在人群总体中呈连续性分布，如社会响应能力得分173,174]。
分析工具
除了G、E 和 ASD 可用性数据的局限以外，与其他类型的流行病学研究相比，由于要使用交叉积回归模型等传统的GxE 检验方法，来估计和检测主要效应，GxE 研究还局限于远高于基本需要量的样本量需求175]。提高统计效率并允许更大样本量的统计学方法已经出现。其中大部分只关注于设计单个基因和环境因素的两因素交互作用模型。检验高阶交互作用和将多基因和环境因素分解为“G” 和 “E” 两个因素的检验方法均已有人提出，包括分级模型的应用185,随机森林方法1811,回归树分析,布尔回归树模型。考虑到 GxE 交互作用的可能性，以及实际情况的复杂可能性，这些统计方法对于未来 GxE 研究的发现和分析具有重要作用。

256    表观遗传的，环境的和生理的因素对自闭症的影响

研究设计及可获得的样本
ASD 相关的GxE 研究一直受限于缺乏合适的样本，样本需要在恰当的神经发育时间窗进行暴露评估、具有严格的表型，且/或有足够的数量来进行统计学分析。要开展同时具备以上3种特征的研究，需面临多种多样的挑战。需要大样本研究来提高GxE研究的效能。但是收集暴露恰当且表型信息详细的大样本将会是极端昂贵的。因此，开展和结合更多暴露细节和后果信息的小型研究，以及具有更大效力的大型研究，都是非常有利的。
几项最近在进行中的ASD流行病学研究，虽样本有限，但暴露评估的细节和结果信息都很详细，已做好开展GxE 研究的准备。这些研究包括病例对照研究，如儿童自闭症的遗传和环境风险(CHARGE)190 和探索早期发展的研究 (SEED)。病例对照研究的潜在局限性在于，它们依赖于回顾性暴露评估。前瞻性队列研究可以保证暴露信息的量表收集和妊娠期生物样本的获取，但样本量需要非常大，以保证充分的检验效能。有一个方法可以解决这一效能问题，即利用妊娠队列设计，仅将那些已经有一名ASD患病儿童的家庭纳入队列中192,193]。ASD 妊娠队列研究目前正在进展中，包括婴儿学习早期自闭症风险的标记(MARBLES)研究和早期自闭症风险的纵向调查研究(EAR-LI)。
鉴于样本量对于GxE 研究非常重要，而ASD 的较低患病率又限制了任何单个研究的样本量，甚至不能满足最小数据收集量，有必要将不同研究中的数据结合起来。这样，暴露变量需要在不同研究间一致，这需要常见暴露评估技术，样本类型和收集时间194]。单一较小的研究可以用于提供不同和特定的遗传背景，或环境暴露因素水平和类型，或允许进行特征描述的深度评估，这在大样本研究中是无法实现的。
另一个检视ASD中 GxE 关系的方法是，利用现有的，起初研究目的并非研究ASD的研究。未选择ASD的出生队列研究可能会包含一小部分的ASD 个体，但经常有深入的前瞻性暴露评估研究，可以向其中增加临床评估，来继续收集ASD 相关的表现型，随着时间的推移当ASD 病例积累到一定数量时，可以与出生队列研究合并。健康登记数据也可以为 ASD 的 GxE 研究文献增添重要信息，主要是由于其庞大的样本量。使用健康登记数据的研究有关环境因素的信息不完整，但可能会有很大作用，因为暴露信息包含在健康记录中，其中可能会有医学状况和药品使用情况。这些更大的队列研究中，有一些可能还包含丰富的妊娠期生物学样本，这些样本可以用于基因分型和暴露评估生物标记。最后，一个大联盟团体已经开始进行ASD的遗传学关联研究。此研究，将暴露数据加入到原有的联合项目数据中，附上警示，说明这只是个

第14章自闭症谱系障碍的基因与环境因素：一个整合的视角    257

回顾性的研究。尽管这些研究中存在暴露评估和基因分型的不利因素，这些样本量仍然可以为GxE 分析提供巨大的检验效能。

未来方向及总结

ASD 风险的遗传和环境因素有越来越多的证据支持了，环境易感性更可能在产前期或出生后早期发生。鉴于大部分ASD病因学研究都聚焦于基因或是环境，我们认为，这些领域的整合有助于更好地了解 ASD。虽然两个领域目前都面临实验设计、评估方法以及统计学问题，但这些是可以被克服的，而且可以通过整合研究互通有无。鉴于基因-环境交互作用对药物和健康的影响，基因-环境交互作用研究领域正迅速地发展到多个疾病的研究中，尤其是流行病学和生物统计学领域。 ASD 研究将能够利用一些协作效应的优势，这些协作效应可以建立起同时进行基因组、表观基因组和暴露组研究的平台。这将是ASD 研究的很有前途的一个时期。这些GxE 特征，一旦被确定，可以影响公共和临床水平的干预策略，并且能够带来个体化咨询、预测和干预。

本章要点

● ASD的遗传和环境风险因素均有证据支持。
●环境易感性最有可能显现于产前期或出生后早期。
● 大部分ASD 病因学研究是单独地关注这两个因素；ASD 研究可以转向GxE 范式的整合，推动研究进展。
●基因分型技术的发展使通过大规模SNP 或序列工作的全基因组分析成为可能，但这一测量方法的范围需要考虑到 GxE 问题。
·GxE 角度的ASD基因组风险因素，需要拓展至包括双亲的基因组。
●暴露评估的时间和精确性十分重要，ASD 这一患病率相对较低的疾病，却常常依赖于病例对照研究和病例家系研究，这将是ASD流行病学研究的一项挑战。
●可获取的具有足够的暴露数据、基因组数据和表型信息的样本量不足，是目前主要的研究局限，也将一直会是一个挑战。一方面我们一定要认识到兼有这三方面详尽信息的有效样本量非常有价值，同时也要提高我们的能力以合并不同研究中具有一致性但信息不太详尽的数据。

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第15章

代际传递的甲基化和基因组的环境因素可能造成的“脑力流失”

Janine M.LaSalle,Keith W.Dunaway
周洋译，陈一心孔学君校

摘要
虽然自闭症谱系障碍有较强的遗传基础，近些年来患病率的明显增高，引起了人们对于环境暴露因素和其与遗传因素潜在的交互作用的担忧。DNA甲基化是DNA序列之上的表观遗传层面，是遗传与环境因素、代谢因素和营养因素交互作用点。DNA甲基化发生在基因与环境因素的交互界面，它位于DNA 序列顶端的表观遗传层面，与代谢和营养相重叠。在此我们回顾并探讨针对遗传因素与子宫内环境复杂交互作用的人群研究结果，同时也检测化学暴露因素对人脑内DNA甲基化作用的影响，以及对发育和生殖的全面影响。化学暴露因素对ASD 风险的跨代影响仍是一个悬而未决的问题，但在此我们总结了支持此类问题的研究结果。
关键词：自闭症；大脑；表观遗传学；表观遗传基因组学；基因组稳定性；毒理学；神经发育；DNA甲基化。

在自闭症的致病风险因素中，我们为何要考虑多代积累的环境因素可能造成的化学性“脑力流失”?

现代人类生活在以人造房屋、高速公路、人造食品、药物和消费品为特征的、相对新的环境条件中。新的环境条件使我们的身体接触了更多的化学暴露因素。新的工业化学物质的急性毒性通常会通过毒性测试测知，但化学暴露的长远结果和对人类健康和后代健康的代际积累影响通常并不会被考虑在内。单一的环境毒物不太可能是自闭症的决定性病因，不过妊娠期化学暴露

272    表观遗传的，环境的和生理的因素对自闭症的影响

的潜在代际积累影响已引起关注。在这一章节，我们综述了化学暴露因素与人类基因组和表观基因组之间复杂的交互作用，以及代际传递效应可能性的多维研究结果。尽管大多数自闭症的病原学风险研究，把遗传风险和环境因素作为相互独立的风险因素来考虑，但两者之间具有复杂相互作用的可能性还是更大些。尤其是考虑到基因可以影响毒物的易感性，环境因素能够通过表观遗传学机制影响基因表达，以及环境诱发的表观遗传学改变可以影响人类基因组的稳定性。

孤独症谱系障碍的复杂病因学

孤独症谱系障碍(ASD) 表现为沟通障碍、社会交往缺陷和重复性行为1。截至2012年3月，美国疾控中心估计有1/88的儿童饱受ASD折磨，10年前，这一比率还仅有1/1502。由于自从1943年Kanner 首次描述了ASD,这一障碍的诊断标准变更了很多次，究竟是患病率真的增长了还是诊断准确性改进了，这个问题并不是很容易回答。诊断手段的不断改变、缺乏明确的实验室检测以及由患者的社会经济学状况造成的获得诊断的难易情形，令ASD 的病因学研究毫无疑问地成为一个复杂的问题。
ASD被认为是高遗传性的，以往的同卵双胞胎研究认为遗传率在90%以上。一项同卵双胞胎和异卵双胞胎对照研究提示，对于ASD来说，共同子宫内环境的风险性(30%~80%)与遗传风险(14%～67%)相比更高8。另一种双胞胎研究的策略是，将ASD视作一组连续性表现的极端最大值，在总人群中测量自闭症症状，以此提高研究样本量。应用双胞胎研究策略对自闭症症状进行分析，在总人群中观察到了高遗传性估计(女性53%,男性72%),研究指出ASD 和自闭症特质有共同的病因学基础。另一双胞胎人群研究强调了“女性保护作用”的证据，女性ASD患者的兄弟姐妹的自闭症症状评分要高于男性患者兄弟姐妹的评分，提示女性患者对ASD有更多的基因贡献!1。这些结合性双胞胎研究提示了ASD疾病风险具有强遗传因素，此外共同的子宫内环境以及性别差异也具有重要作用。
最新的基因组技术为许多ASD复杂遗传性的进一步认识提供了工具。有大量研究使用全基因组分析方法来分析常见遗传变异，最新的关注点是确定 ASD 个体与其他人群相比，罕见和新生突变的遗传变异更为多见。从拷贝数变异(CNV) 微阵列分析发现的罕见变异共同证明，6%～8%的自闭症病例发生 CNV, 相比之下非自闭症个体仅有1%～2%。为了确定ASD 与蛋白编码基因的罕见变异有关，使用全基因组外显子测序(WES) 法进行的测序研究

第15章代际传递的甲基化和基因组的环境因素可能造成的“脑力流失” 273

确定的大部分是非重叠的候选基因突变。在一项研究中，和正常发育个体相比，ASD个体的基因全敲除发生率高了两倍,但另一项WES 研究比较了1039例ASD对象和870例对照组，没有发现 ASD个体中外显子变异的富集均提示可能有上百个基因与ASD 的遗传体系结构有关。ASD的复杂遗传体系结构开始显现的开端，是在罕见 ASD病例中发现的变异、缺失或重复基因与一些互相交叠的功能通路密切相关，包括突触功能和染色质功能。
这些ASD基因组研究提出了一些有趣问题：①在共同的通路中，敲除个别基因会在罕见个体中引发ASD,是否存在很多更常见的，扰乱这些基因相关的整个通路的方式?②ASD中的新生突变是怎么发生的?新生突变是完全随机发生的，还是其发生的风险与遗传多态性和环境交互作用有关，尤其是在常见 CNV 断点上?③如何解释ASD 疾病风险中丢失的遗传性?

基因组与环境交互作用层面上的DNA 甲基化

DNA分子主要由其4个碱基(A,T,G,C,)    的排布方式决定，DNA还包含额外的表观遗传学修饰如 DNA甲基化。同时，染色体DNA 是作为染色质传代的，染色质是细胞核内存在的核苷酸蛋白质复合体。表观遗传学可被认为是不改变DNA序列，但可以改变基因表达和最终表现型的核苷酸或染色质的修饰。表观遗传修饰被认为以一种“相对稳定”的状态存在，也就是说它们可被遗传且/或存在时间长，但在合适条件下也是可逆的。
DNA甲基化是表观遗传学的第一个层面，与非编码RNA、蛋白质组、远程染色质交互作用，也和表观遗传学的另一个层面的组蛋白修饰共同作用26]。基于对启动子甲基化，X 染色体失活和印记基因沉默状态的了解，DNA甲基化一直被认为是哺乳动物的启动子沉默标记。然而全基因组分析 DNA甲基化模式时发现，人类基因组中DNA甲基化高度饱和，但在胚胎干细胞和人脑等成熟组织中，CpG 岛是明显的未甲基化的。DNA启动子甲基化与基因表达呈负相关，不过基因体的甲基化与基因表达则呈现了正相关。
据推测，DNA甲基化在保护性防御哺乳动物进化过程中逆转座子和其他的重复DNA 片段的蔓延性扩张过程中，具有一定作用[30-321。人类基因组内包含了一大部分重复序列，总计大约占3GB 区段中的一半。在核糖体基因、着丝粒、端粒体都发现了重复序列，也发现了散布在染色体内的转座子驱动的重复、加工后的假基因以及简单的序列重复。大部分哺乳动物有同样的常见重复类别，灵长类最近增加了独特的一类被称为片段重复的“低拷贝”重复。这

274    表观遗传的，环境的和生理的因素对自闭症的影响

些灵长类特有的片段重复的特征是在CpC 密集的富含Alu的断点，而这是极好的DNA甲基化靶点。有趣的是，这些富Alu的片段重复与人类神经发育障碍中常见的CNV 断点相一致，并且在自闭症个体中水平更高33,34]。

神经元甲基化及其对自闭症的重要性

不同于在大部分细胞和组织间都不变的人类基因组，甲基化谱在早期精神发育谱系中是动态变化着的，并在体内不同组织中表现不同。碱基对的基因序列分析提示，甲基化谱在胚胎干细胞和不同类型分化细胞之间表现出显著的差异。分化型细胞系如 IMR90 胚肺成纤维细胞和SH-SH5Y神经母细胞瘤细胞等，展示了不存在于胚胎干细胞中的部分甲基化域(PMD) 的甲基化谱特征。在胚胎肺纤维母细胞内PMD含有40%IMR90基因组，由于大量神经元特异的高甲基化域(N-HMD) 的存在，SH-SY5Y 基因组却仅有19%。 N-HMD中基因的基因本体主要分以下几类：神经元分化，突触传导以及钙信号系统。H-HMD基因在自闭症候补基因中也显著增多。
除了CpG 位点上的5-甲基胞嘧啶(5-mC)之外，神经元还包含相对较高水平的至少两种类型DNA 甲基化：在非CpG 位点上的高度保守甲基化(mCH, 包括 CpA,CpC 和 CpT) 以及CpG 位点上的5-羟甲基胞嘧啶(hmC) 。人类和小鼠脑内细胞类型的全基因组序列分析显示，与非神经元细胞相比，神经元细胞有独特的甲基化模式27]。此外据观察，胚胎期和出生后大脑甲基化水平有很大的变化，就神经元的上调基因而言，它的特点是基因本体5-hmC甲基化水平较高，而mCH甲基化水平较低27]。为了理解哺乳动物脑内甲基化变化的动态性，还有许多研究有待开展，但这些不同甲基化类型(CpG,CHH,CHG,5-mC,
以及5-hmC)的基因组路线图已经表明，DNA甲基化在神经元中高度饱和，而且神经元基因被不同的甲基化模式所标记。
有关催化DNA 上甲基的增加和移除的酶缺乏的研究，显示了DNA甲基化在哺乳动物神经系统中的重要作用。前脑中缺乏两种催化DNA甲基单位增添的酶(Dnmtl和 Dnmt3a) 的小鼠，在记忆形成和行为可塑性方面表现出缺陷36,37]。由5-mC到5-hmC的转化是在对脱甲基反应具有重要作用的TET 酶家族的催化下完成的。Tetl敲除削弱了Bdnf 和 Fgfl基因启动子的神经元功能依赖性脱甲基反应，这表明了脑内动态甲基化改变的作用38]。但是，整体DNA 模式和胚胎脑至成人脑的动态变化只在Tet2⁻¹-小鼠的脑中有微小的改变，野生小鼠脑中则无[27,这提示，也有许多TET 酶参与了改变脑内DNA 甲基化模式的协同作用，或者有其他的脱甲基作用机制参与其中。
总之，这些精神发育神经元甲基化谱的全基因组图表明，基因表达模式

第15章代际传递的甲基化和基因组的环境因素可能造成的“脑力流失” 275

中，DNA甲基化有重要的作用。然而，胚胎脑和成人脑之间，或者神经元和神经胶质细胞之间的甲基化差异究竟有多大，目前还并不明确。神经元发育和突触形成的特定基因似乎只存在于以非神经元分裂细胞中的异染色质为特征的PMDs中。染色质不可接近性或许可以解释胎盘中出现 PMD²⁹和神经元中的非CpG甲基化“沙漠”。神经元基因的特征是除CpG 启动子以外的全面高水平DNA甲基化。这提示在神经元成熟进程的动态转录过程中，CpG 基因体需要被甲基化，而CpG启动子需要脱甲基化。这一结论也提出了有关哪些因素可能会在子宫内或新生儿脑发育中，影响复杂的甲基化过程，以及自闭症病因的问题。
研究显示，人类死后大脑和血液中DNA甲基化模式的改变可能为ASD 表观遗传病因学提供了依据。在死后大脑研究中，候补基因方法确定了MECP2 启动子和UBE3A3'端的异常甲基化与自闭症之间相关联40,41]。在一项仅有一方诊断为孤独症的同卵双胞胎血源性细胞甲基化差异的遗传学分析中，发现了节律基因RORA 的甲基化改变，并已在死后大脑研究中得到了确认42]。最近一项有关甲基化改变与自闭症之间关联的大规模研究，使用Infinium450k 阵列平台分析确定了孤独症脑内许多基因的甲基化模式出现了普遍的变化。

环境毒素是如何影响代谢通路进而调控DNA 甲基化的?

人脑基因组显然充满了DNA甲基化，但是什么调控了DNA 甲基化中甲基的供应，和DNA甲基化酶与脱甲基化酶呢?答案尚不完全明确，细胞代谢的表观遗传学交叉研究可能提供了一些解答。此外，环境化学物质和表观基因组，尤其是甲基化谱的交叉作用，与一些基本的细胞代谢系统有关联。
与 DNA甲基化关联最大的中心代谢途径是一碳单位或甲硫氨酸循环，作用是为 DNA、RNA 和蛋白质甲基化提供甲基(图15-1)。DNA甲基转移酶 (DNMT)需要甲硫氨酸产生S-腺苷甲硫氨酸(SAM),DNA 甲基化的甲基供体。膳食因素对于甲硫氨酸循环的供给则十分重要，包括产生甲硫氨酸的叶酸循环中的胆碱和维生素B44]。反过来，将SAM转化为SAH 的 DNA甲基化反应也需要甲硫氨酸。在 A小鼠遗传模型和蜜蜂的蜂后决定性471中已知，叶酸和维生素B 是DNA甲基化的环境修饰因素。
在人类研究中，产前维生素的使用，包括孕前的叶酸高摄入量，与 ASD 疾病风险的降低显著相关。对于一个携带编码叶酸循环酶亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR) 风险等位基因的女性来说，如果在怀孕前没有大量摄入维生素，她们的孩子将有很高的风险罹患自闭症，这证明了基因与环境交互作用的

276          表观遗传的，环境的和生理的因素对自闭症的影响

图15-1 调控 DNA 甲基化的代谢途径与营养、化学和免疫途径之间的交互作用。一碳单位代谢循环的代谢水平对于甲基化过程中SAM 向 SHA 的转化十分重要，对于免疫反应的中心调控，氧化应激和受许多环境毒素影响到的谷胱甘肽途径也很重要。叶酸和胆碱等营养素可以通过不断代谢帮助阻碍毒物和免疫损害
重要性。一项纳入8个病例对照研究的荟萃分析也确定了ASD 与 MTHFR 风险等位基因的显著相关性，尤其是在没有叶酸预防性摄入的国家51]。
免疫系统也能够通过叶酸受体自身抗体来阻碍叶酸运输。一项研究指出，75%的ASD 血液样本中叶酸受体自身抗体呈阳性，阻碍了叶酸通过血脑屏障的运输。另外，能够识别胚胎大脑抗原的ASD 特异性母体自身免疫抗体已被确认存在，包括乳酸脱氢酶、压力诱导型磷蛋白1、崩解反应调节蛋白以及Y-box结合蛋白54]。
环境毒物影响一碳单位循环，主要是通过谷胱甘肽和氧化应激通路的反应。随着氧化应激的增长，甲硫氨酸合成酶和生成的甲硫氨酸减少。这一过程还与抗氧化剂谷胱甘肽产出的增加和代谢活动的广泛减少紧密耦合55。研究发现，和对照组相比，ASD 儿童的甲硫氨酸、SAM 和同型半胱氨酸水平明显偏低，但 SAH 和氧化型谷胱甘肽的含量却较高。在ASD个体中还观察到了甲硫氨酸合成酶(MTR) 的转录水平降低和剪切模式的改变，对照组中则无55。此外，DNA甲基化水平低的ASD样本中SAH 水平的升高，说明了血液中甲基化水平的代谢失衡。氧化应激的活性氧类对线粒体功能有一定影响。许多研究已经发现了逐渐增加的ASD儿童线粒体损害。

第15章代际传递的甲基化和基因组的环境因素可能造成的“脑力流失” 277

环境暴露因素影响脑内甲基化作用的依据

DNA甲基化是环境因素影响支持证据最多的表观遗传学层面。环境暴露因素对脑内甲基化作用或发育和繁殖影响的证据概括在表15-1 中。此外，研究证明，影响成年期组织的特定的遗传暴露因素也很多，但这些研究并未收录在表15-1中，因为它们并非本章所关注的重点。
甲基汞等重金属的影响可以被稀有元素膳食抵消，比如硒61]。少量的硒对于人类非常重要，因为一个抗氧化剂通路，谷胱甘肽过氧化物酶的活化过程中需要硒。然而，对斑马鱼的研究则显示，过量的硒会影响胚胎生长，导致神经元形成错误63]。形成甲基汞的过程，首先是汞进入环境中，一般是通过工业排放[⁶4];然后，水生动物系统中的厌氧生物通过在无机的汞上添加甲基来产出甲基汞。许多研究发现，整体的低甲基化与甲基汞暴露相关65,66,而基因特异性的甲基化差异是多方向的。
以往研究认为，处方药可能会对DNA甲基化产生意想不到的影响，这一结论直到最近才被确认。自1940年起，在近30年间，合成的非固醇类雌激素己烯雌酚(DES) 作为一种内分泌干扰物，一度被用于防止孕妇流产69]。医生们错误地认为DES 可以降低妊娠并发症的风险，直到1971年，研究证明妊娠期DES 使用提高了阴道肿瘤的风险,此类处方才逐渐停止。DES 对 DNA甲基化的整体影响尚不明确，但有研究在生殖系统组织(子宫和睾丸)中发现多个基因的 DNA甲基化增多[71-73。还有证据证明Nsbp1⁷4 基因上存在低甲基化状态。
双酚A(BPA) 是一个碳基化合物，自20世纪50年代起，一度被用于制作各种类型的树脂和塑料。BPA 对多个器官产生广泛的影响，包括脑和生殖系统组织。此外，包含 BPA 的化学混合物还会降低精子内的DNA甲基化水平。
多氯联苯(PCB) 和多溴联苯醚(PBDE) 是结构相似的持久性有机污染物，均含有结合卤素的2个相连苯环85。这些持久性有机污染物被证实与人和小鼠脑内的整体低甲基化有关。
这些研究的共同结论是，多种化学物质和混合物可能会影响脑和生殖系统的甲基化谱。整体DNA甲基化的分析显示，甲基化水平的降低可在不同的物种、组织和暴露因素中发生，证实了前文讨论过的甲硫氨酸和谷胱甘肽路径的共同损害。有趣的是，基因特异性启动子的高甲基化常常在整体低甲基化的组织或暴露因素中被观察到，这是胎盘和癌症PMD 基因的表观遗传学标志。

表15-1环境暴露因素对脑内甲基化作用或发育和繁殖影响的证据

暴露因素
甲基化改变方向
基因
物种
组织类型
参考文献

硒两者皆有(依赖于胚胎发育阶段)
整体
斑马鱼胚胎(受精后24/26和48 小时)

甲基汞高 BDNF(启动子) 小鼠脑(海马)
甲基汞低整体大鼠神经元干细胞(NSCs)
甲基汞低整体貂脑(大脑)

甲基汞
无变化谷胱甘肽受体(GR
启动子) Sprague -Dawley大鼠
海马和肝脏

己烯雌酚

高

HOXA10(内含子)

人类人子宫内膜间质细胞系 (类子宫的)
和Ishikawa细胞系(子宫 )

己烯雌酚高 c-fos基因(启动子) CD-1小鼠子宫

己烯雌酚
高 Mobkl2c,BC023892, Gm203,Ifih1
C57BL/6小鼠
附睾(睾丸)

己烯雌酚低 Nsbp1(启动子) CD-1小鼠子宫
乙烯菌核利高 LPLase基因 Fisher大鼠附睾，精子
双酚A 两者皆有整体 ICR/Jcl小鼠胚胎前脑
双酚A 低 Hoxa10(启动子) CD-1小鼠子宫
双酚A 低 Hoxa10 ICR小鼠 F2小鼠的外子宫角

续表

暴露因素
甲基化改变方向
基因
物种
组织类型
参考文献
双酚A 低 lgf2r和Peg3 CD-1小鼠卵母细胞
双酚A 低 Igf2r,Peg3和H19 小鼠胚胎胚胎细胞
双酚A 低 H19 ICR Holtzman大鼠精子、胚胎
双酚A 高 Crtcl C57BL/6小鼠海马

双酚A 两者皆有(性别特异 ) ERa(Esrl)(启动子，基因间的)
BALB/c小鼠
全脑

双酚A 低 B6和C7杂交小鼠胎盘
双酚A 高 Stra8 CD-1小鼠卵母细胞
混合物：BPA,bis(2-甲基 Sprague
丙烯酸异辛酯),邻苯 Dawley大鼠
二甲酸酯(DEHP),二丁基邻苯二甲酸酯 (DBP) 两者皆有整体精子
多氯联苯(PCB) 两者皆有 AHRI 大西洋科小鱼肝和脑
多氯联苯(PCB) 低 LINE-1(整体) 人类血液
多氯联苯(PCB) 低 LINE-1(整体) 人类死后人脑
多溴联苯醚低整体小鼠脑

280    表观遗传的，环境的和生理的因素对自闭症的影响

环境暴露因素的代际传递效应证据

化学物质暴露引起的甲基化改变产生的一个主要问题是，这些表观遗传学改变是否会遗传至下一代。大部分甲基化标记，比如涉及X 染色体失活或亲本印迹的那些，在配子中会被抹去并重构，因此甲基化改变不太可能被传递到后代中去92]。但是，哺乳动物基因组是高度重复的，重复序列不受配子形成过程中的整体多次脱甲基化作用影响，这提示一些整体甲基化水平记忆可能会被遗传到下一代3]。还没有相关研究提供全基因组水平的 DNA甲基化代际传递效应证据，可能是由于多基因研究的代价较高有关。不过，仍有一些研究提供了环境暴露因素对代际传递效应影响的证据，概括于表15-2。
乙烯菌核利是一种二甲酰亚胺类杀真菌剂，用于人类和玉米作物的疾病治疗。有关乙烯菌核利的代际传递效应的一些研究结论是互相矛盾的。大部分表明乙烯菌核利代际传递效应的研究源于同一个实验室，在多项大鼠和小鼠的研究中显示存在 DNA 甲基化和/或表现型改变94-99】。然而， Vandegehuchte 等人对浮游甲壳动物的研究显示，表现型和表观遗传影响是没有相关性的。值得注意的是，Anyway(2005)的实验结果显示乙烯菌核利喂养的大鼠并没有发生显著变化，并且这一实验结果被Inawaka 成功重复了 (2009)。另外，生产乙烯菌核利(烯菌酮)的药品公司BASFSE,资助了两项由Schneider等人进行的研究，研究结果显示在不同的大鼠模型中，乙烯菌核利均无代际传递效应。
由于DES曾被用于妊娠期母亲，她们女儿的暴露风险涉及了可以产生隔代影响的卵母细胞。在一项有关DES 暴露母亲的孙代研究中，结果显示尿道下裂(先天性尿道缺陷)的患病率显著提高103。
BPA 已在多项研究中被证实具有代际传递效应。大鼠精子中的低甲基化 DNA与 BPA混合物的传代结果相关84]。F2 代 BPA 喂养小鼠中，存在子宫角 DNA低甲基化和体重增长76。而且，在一项研究中BPA 喂养小鼠后代的社交影响一直在F4 代还可见[104。

表15-2环境暴露因素对代际传递效应影响的证据

暴露因素影响物种组织类型参考文献
乙烯菌核利乙烯菌核利代际间LPLase基因甲基化增长 Fisher大鼠附睾精子
直接与Anway的研究结论相矛盾(2005) Fisher大鼠附睾精子

乙烯菌核利脱离暴露的女性三代能够辨别并更容易将影响传递至没有暴露历史的男性，而男性则无此类表现
Sprague -Dawley大鼠
行为表现型

乙烯菌核利 F2代暴露的尺寸减少(长度)以及F2代的低甲基化大型蚤(浮游甲壳动物)

乙烯菌核利使F3代多个启动子上DNA甲基化增长或减少 Harlan Sprague -Dawley 大鼠
精子

乙烯菌核利 VCZ暴露与完全甲基化的H19和Gtl2等位基因的低甲基化相关，与未甲基化的Prgl,Snr- pm和Peg3等位基因则无关。 VCZ的影响是跨代的，但从F1到F3代会逐渐消失

FVB/N小鼠

精子

乙烯菌核利代际间LPLase基因甲基化增长 129代近亲繁殖和CD1 远系繁殖小鼠睾丸，前列腺，肾脏和卵巢

乙烯菌核利特异位点(经MeDIP检测)上DNA甲基化的增长和减少以及表型效应 Hsd Sprague Dawley HTMSDHTM
远系繁殖种系(Harlan)的雌性和雄性大鼠

原始胚胎细胞(PGC)

续表

暴露因素影响物种组织类型参考文献

乙烯菌核利 DNA甲基化的增长和减少以及RNA转录改变(包含路径分析)
Wistar大鼠
多部位

乙烯菌核利无显著的行为或形态变化(至F3代) Wistar大鼠全鼠
己烯雌酚无显著形态变化(至F3代) 人类尿道
F2代男性尿道下裂
BPA 社会交往能力的破坏以及转录改变(至F4 代 ) C57BL/6小鼠全脑
混合物：BPA,bis(2-甲 Sprague Dawley SD(Har-
基丙烯酸异辛酯), lan)大鼠
邻苯二甲酸酯(DE- HP)二丁基邻苯二甲酸二丁酯(DBP) 整体的高甲基化和低甲基化精子
双酚A HOXA10基因(内含子)的低甲基化 ICR小鼠 F2代右侧子宫角

第15章代际传递的甲基化和基因组的环境因素可能造成的“脑力流失” 283

ASD 的环境暴露因素和代际传递效应证据

要找到提升ASD 疾病风险的特定环境因素是很困难的，因为与基因变异和 CNV一样，这涉及与其他暴露因素、营养物质和基因的复杂交互作用。不过，类似于ASD中效应尺度很大的罕见基因变异，效应尺度很大的罕见暴露因素也可以通过环境因素的循证研究与ASD 相互关联。风疹感染或沙利度胺、丙戊酸钠等药物的妊娠期使用已被证实与 ASD 风险的成百倍增长有关。ASD风险的增长还与空气污染、农药和持久性有机污染物等环境污染的母体暴露有关109-18]。在一项出生证明数据分析研究中，自闭症儿童的母亲在化学物质暴露的工作环境中工作的可能性是对照组母亲的两倍。而父亲的相同职业暴露则并无显著相关的风险。许多妊娠期因素也许ASD 疾病风险的增长有关，包括孕妇高龄、妊娠期糖尿病、胎儿生长不足、预产期推迟以及两次妊娠间隔较短。
人类传代流行病学研究直到ASD 出现才开始。研究发现，祖母或祖父的年龄越高，孙代的ASD患病风险就越高，呈现出代际传递效应。基于大量人群基础的“护理人员健康研究Ⅱ”证实了ASD患病风险的增长与母亲儿童早期遭受虐待有关127]。显然，为了解可能与 ASD 病因学相关的化学暴露因素的代际传递效应，未来还需要更多研究工作。最近，我们对在100例死后大脑样本中PCB 和 PBDE 进行了分析研究，得到了一个引人关注却出乎意料的结果：母体15q11-q13 基因重复(Dup15q)的基因CNV 与 PCB-95 水平显著相关，尽管研究对象出生于PCB 已被禁用的20世纪70年代以后115]。在同时有PCB-95 和 Dup15q 的研究对象中，LINE-1 焦磷酸测序分析发现存在整体 DNA低甲基化的状况，提示有表观遗传学影响。这些结果都证明了前一代的化学物质暴露，可能会通过导致不稳定性的甲基化改变或者基因-环境结合 (GxE) 效应，诱发下一代中新生CNV的重新合成。

未来方向

在这一章中，我们综述了ASD的复杂病因学证据，涉及遗传学、代谢作用、膳食因素以及化学物质暴露的交互作用。由于把任何一个风险或保护因素与其他因素相互隔离的研究，都可能得出不全面的结论，我们认为未来的研究应纳入表观基因组，尤其是甲基化谱，以及它是如何影响ASD的(图15-2)。这些研究面临的挑战是，人脑标本只能于死后获取，所以未来的研究路径可能仍是人类流行病学研究与人类死后大脑研究和动物模型研究相结合。

284          表观遗传的，环境的和生理的因素对自闭症的影响

和环境因素更容易控制。环境暴露因素的跨代研究需要被进一步推进，为了建立有关代际保持表现型的因果关系，研究还应包括基因变异和甲基化改变的全基因组分析。鉴于基因组测序越来越标准化，价格也更便宜了，精心设计的动物研究将有希望提供更有价值的结果。
但由于DNA甲基化和基因表达模式常常具有组织特异性，使用死后大脑样本和人类干细胞上的神经元进行的人类研究仍会有重要意义进行人类神经元研究，将可能对检视环境暴露因素对ASD 个体基因组及表观基因组的作用至关重要。

本章要点

●虽然ASD 疾病风险具有强遗传性，但 ASD 中已知的大部分基因变异都是

第15章代际传递的甲基化和基因组的环境因素可能造成的“脑力流失” 285

新生突变的。
●人类双胞胎研究和大量人群研究显示了母体子宫内环境对 ASD 风险的影响。
● 在ASD 中，DNA 甲基化的表观遗传层面，是遗传、环境风险和保护因素的交叉界面。
●发育中的脑具有动态的甲基化谱，这提示甲基基团在正确的时间和地点，恰当地沉积于特定的基因位点，对于正常的大脑功能十分重要。
●环境毒物对DNA 甲基化模式和整体DNA 甲基化水平的影响，已在多种生物体中得到证实。
●既往环境毒物的跨代影响，已在动物模型研究中找到了依据，应更进一步地在ASD 病因学方面进行研究。
●未来的研究应致力于在不同代际之间、不同系统内，将遗传、环境和表观遗传分析一体化。

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第16章

自闭症谱系障碍的氧化应激和线粒体功能障碍

Feng Gu,Ved Chauhan,Abha Chauhan 宋瑞译，孔学君校

摘要
自闭症谱系障碍(ASD) 是复杂的多因素疾患，涉及各种遗传易感性与环境因素的相互作用。虽然自闭症的原因难以确定，许多研究表明氧化应激和线粒体功能障碍参与了ASD的病理生理过程。几项研究报告表明，在自闭症受试者的血浆、尿液和/或脑组织中，代表脂质过氧化、蛋白质和DNA氧化以及抗氧化防御受损的氧化损伤标志物的水平有所升高。我们和其他研究团队也报告了谷胱甘肽(GSH) 水平和谷胱甘肽/氧化型谷胱甘肽(GSSG) 比率的降低，以及自闭症受试者血液和脑样本中GSSG水平的增加，显示自闭症患者的谷胱甘肽氧化还原失衡。参与GSH 体内平衡的酶的活性，即谷胱甘肽过氧化酶(GPx), 谷胱甘肽-S-转移酶(GST) 和谷氨酸半胱氨酸连接酶(GCL) 在自闭症患者中受损。GSH、GPx 或 GST 基因的多态性与自闭症的相关性也有报道。线粒体不仅是自由基的来源，也是氧化损伤的靶点。线粒体中的电子传递链(ETC) 是 ATP 生成所必需的。能量代谢、蛋白表达和ETC 复合物活性以及线粒体DNA中的缺陷在自闭症受试者的血液、肌肉活检和脑样本中已有报道。所有这些结果表明氧化应激和线粒体功能障碍在自闭症的病理生理过程中发挥关键作用。
关键词：自闭症谱系障碍；电子传递链；谷胱甘肽；线粒体功能障碍；氧化应激。

前言

自闭症谱系障碍(ASD) 是表型各异的神经发育性障碍，其核心症状为社

296    表观遗传的，环境的和生理的因素对自闭症的影响

会交往和沟通技巧的功能障碍，局限性兴趣，重复刻板的言语性和非言语性行为。最近的证据表明ASD的发病存在基因-环境的相互作用。自闭症的神经生物学和遗传学目前尚不清楚。虽然自闭症的原因尚不明确，但许多研究表明氧化应激和线粒体功能障碍参与了ASD的病理生理过程。
氧化应激可以定义为自由基生成和细胞的抗氧化机制之间的失衡，从而导致过量的活性氧(ROS) 。在正常情况下，ROS 的产生和细胞的抗氧化能力之间存在着动态平衡。ROS 在氧化代谢和线粒体的能量产生期间内源性产生1,12],并被抗氧化防御体系所中和。抗氧化防御包括酶类如超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT) 和谷胱甘肽过氧化物酶(GPx),及非酶类抗氧化剂如谷胱甘肽(GSH)、维生素E 和 C、金属硫蛋白和酚类化合物组成的保护性机制。ROS在某些病理条件下以及由于环境因素的影响会急剧增加。它们化学性质不稳定，可攻击并损伤细胞的重要组分，如多不饱和脂肪酸、蛋白质和核酸。受损的抗氧化系统可导致细胞膜损伤，膜流动性和通透性的改变以及氧化应激状态。氧化应激对大脑特别有破坏性，因为大脑具有较高的能量需求，高浓度的多不饱和脂肪酸和较低储量的GSH, 而 GSH 是最重要的抗氧化防御机制。神经元是第一个被增加的氧化应激所影响的细胞。一般认为氧化应激在老化和一系列疾病中发挥重要作用，包括心血管疾病、糖尿病、高血压、精神病、神经变性和神经发育性疾病。
ROS是线粒体中质子循环的副产物。线粒体是非常重要的细胞器，它生产三磷酸腺苷(ATP),ATP 作为能量载体在大多数哺乳动物细胞中通过氧化葡萄糖和脂肪酸而产生。电子传递链(ETC) 是线粒体的重要组成部分，并由含有5个亚基的酶类复合物组成，即复合物I(NADH 脱氢酶),复合物Ⅱ(琥珀酸脱氢酶),复合物Ⅲ(细胞色素bcl复合物),复合物IV(细胞色素c 氧化酶)和复合物V(ATP合成酶)。复合物I～IV 参与生成跨越线粒体内膜的质子梯度(线粒体膜电位),而复合物V运输质子从膜间隙到线粒体基质。复合物V 利用质子梯度来催化二磷酸腺苷(ADP) 磷酸化形成ATP 的过程。复合物I 和Ⅲ是线粒体超氧化物(O₂-)生产的主要位点。ROS的产量由复合体I 高度调控。在正常生理条件下，ROS被中和并被SOD 转化为过氧化氢(H₂O₂) 。然而，当ETC受影响时，过量的电子可以直接传递给O₂以产生超氧化物阴离子。除产生能量外，线粒体也在维持细胞内钙稳态以及氨基酸、脂质和类固醇代谢中发挥关键作用，从而调节发育过程，包括神经轴突生长，轴突可塑性和突触可塑性。特别是神经元突触是高能耗区域，因此特别依赖线粒体功能21,25]。线粒体集中在树突和轴突末端，直接参与ATP合成、钙稳态和突触可塑性维持26]。
线粒体有少量自己的DNA。ETC复合物I,Ⅲ,IV 和V的十三个亚单位由

第16章自闭症谱系障碍的氧化应激和线粒体功能障碍    297
37个线粒体DNA(mtDNA)基因编码27],其他的亚单位则由超过850个的细胞核DNA(nDNA)基因编码28]。因此，线粒体功能受到mtDNA和 nDNA的双重遗传控制。mtDNA的表达、复制和维持也需要由细胞核基因编码的因子的参与。因此，mtDNA和/或nDNA 基因组突变可能引起ETC 复合物的缺陷，随后导致线粒体功能障碍。

自闭症中的氧化应激

我们和其他团队累积的证据表明氧化应激可能在自闭症的发病和临床表现中发挥重要作用1-7,9,30-37】。Rossignol 和 Frye 进行了一项全面的ASD 的文献搜索，在所有115项研究ASD氧化应激的文献中均报道了ASD 和氧化应激之间的关联9]。
自闭症中氧化损伤的标志物水平增加

据报道，在来自自闭症受试者的血液，尿液和/或脑样本中，几种氧化应激的生物标志物水平增加。这些包括升高水平的①脂质过氧化标记物，例如血液中的丙二醛(MDA)31,35,38,39],F2-异前列烷(F2-isoprostane);② 蛋白氧化/硝化标记物，即尿液或血浆中的蛋白质羰基或血浆43中的3-硝基酪氨酸(3-NT);以及 ③DNA 氧化标记物，即大脑中的8-羟基鸟苷(8-0HG),大脑42]或尿液。此外，据报道，氧化应激的程度与自闭症的严重程度有关36,37]。
自闭症中抗氧化防御的减弱
谷胱甘肽(GSH) 是环境毒素和ROS最重要的内源性清道夫。它还参与维护基本的巯基状态，半胱氨酸的储存和细胞分化、增殖和凋亡的调节。在正常条件下，GSH是主要形式，而GSSG 含量低于GSH 总量的1%～1.2%。这些发现为自闭症个体的谷胱甘肽-氧化还原失衡提供了证据。
GSH合成发生在细胞质基质中，包括两个连续的ATP依赖性酶反应。首先，谷氨酸与半胱氨酸偶联形成γ-谷氨酰半胱氨酸(γGC), 这个过程由关键的 GSH 生物合成限速酶谷氨酸半胱氨酸连接酶(GCL)催化。然后， γGC 与甘氨

酸偶联形式GSH, 该反应由谷胱甘肽合成酶(GS) 催化。在最近发表的文章中，我们报道了自闭症受试者的小脑相较于对照组 GCL 活性降低，而GCLC (GCL 的一个重链或催化亚基)与GCLM(GCL的一个轻链或调节亚基)的蛋白质水平比率增加。此外，在对照组受试者中，GCL的活性和GCLM与 GCLC 亚基的蛋白质水平呈强阳性相关，而自闭症受试者中则不然，表明GCL活性的调节在自闭症中受到影响。
GSH 被GPx 氧化成GSSG,而在谷胱甘肽还原酶(GR) 催化的反应中GSSG 被还原成GSH 。GPx和 GR 是涉及ROS消除的抗氧化酶。谷胱甘肽-S-转移酶 (GST) 是另一种抗氧化解毒酶，它参与氧化产物的解毒，是通过将GSH 与许多毒性底物的亲电子的中心区结合而形成无毒产物实现的。最近，我们已经报道了自闭症受试者小脑中的GPx 和GST的活性受损54]。这些结果表明，涉及维持GSH 稳态的酶在自闭症的小脑中活性受损，较低的GCL 活性可能与 GCLM的蛋白表达降低有关。
自闭症个体血液中抗氧化酶GPx35,40,5-59],GST⁵1],GR⁵1],SOD35,5,57,59-62]和 CAT⁵5,59,60]活性的改变在很多研究中都有报道，有时也有冲突的结果。最近，关于自闭症氧化应激相关的生物标志物和GSH 水平的两个独立的系统评价和荟萃分析由Main等人 5 和Frustaci 等人6完成。它证实自闭症的血浆中GSH水平较低而GSSG水平较高。ASD受试者的红细胞中GPx活性较对照组显著降低，而血液中的SOD活性未能发现与自闭症有任何显著关联⁶。外源性抗氧化剂对于防止毒素的损害也很重要。自闭症个体血液中的维生素E、维生素 A 和番茄红素有所减少[37,55,63】。
氧化应激通路的异常基因可增加氧化应激的易感性。自闭症中与 GSH,GPx或 GST有关的基因多态性已被报道。Bowers等人6检查了自闭症遗传资源交换库中318个家族中的与谷胱甘肽相关的42个基因的遗传变异，结果表明自闭症和胱硫醚γ-裂解酶、谷氧还蛋白、谷氧还蛋白3有显著相关性。

自闭症中的线粒体功能障碍

线粒体不仅是自由基的来源，也是氧化损伤的靶点。线粒体本身不能合成 GSH, 但它通过能量依赖性转运体从胞质溶胶中转运10%～15%的 GSH⁶7] 。因此，线粒体中GSH的耗尽使细胞更容易受到氧化应激损伤。线粒体功能障碍将导致几种结果：ATP 产量减少、ROS增加和氧化损伤、神经传递系统的改变以及诱导细胞凋亡。线粒体功能障碍和氧化应激与多种神经变性疾病有关，如阿尔茨海默病(AD) 、帕金森氏症(PD) 、肌萎缩性侧索硬化

第16章自闭症谱系障碍的氧化应激和线粒体功能障碍 299
(ALS) 和亨廷顿舞蹈症(HD)以及神经发育障碍。越来越多的研究强调线粒体功能障碍可能在自闭症中具有重要作用8-10,68-78]。
自闭症能量代谢缺陷
在自闭症人群中线粒体病(MD) 的患病率为5.0%,比其在一般人口中的0.01%的患病率要高得多。线粒体病常常由基因突变或缺失引起，而线粒体病的诊断是复杂的，主要取决于ETC 复合体功能的显著减低和已知的 mtDNA突变80。只有23%患有自闭症/线粒体病儿童有已知的mtDNA异常。大多数患有自闭症/线粒体病儿童没有具体的遗传突变来解释线粒体疾病。然而，自1993年以来自闭症大脑能量代谢缺陷已被许多生化、遗传、解剖和神经放射学的研究所证实。最近的几项研究已经证实脑能量代谢的多种生物标志物在自闭症受试者中有所改变，如高水平的乳酸，丙氨酸，乳酸与丙酮酸比率，丙氨酸与赖氨酸比率和低肉碱水平，这些结果提示能量合成障碍可能对相当一部分自闭症患者有影响。丙酮酸脱氢酶(PDH) 的酶活性在自闭症受试者的额叶皮质和淋巴细胞中显著降低。降低的PDH 活性将导致丙酮酸至乙酰辅酶 A(CoA)脱羧过程的减少，三羧酸(TCA) 循环活性受损，NADH产生减少，以及自闭症中的丙酮酸至乳酸和丙氨酸的代谢增加。Boccuto 等⁹2最近报道了来自自闭症受试者的淋巴母细胞在色氨酸是唯一的能量来源时，与对照组相比减少了NADH 的产生。NADH 是一种用于ETC 的重要能量载体，电子从 NADH中通过ETC 复合体I,Ⅲ 和IV被转移到O₂ 。因此，线粒体功能障碍也可能由异常的色氨酸代谢引起，它是5-羟色胺、喹啉酸和犬尿酸的前体。
自闭症线粒体ETC 复合体活性和蛋白表达缺陷
线粒体功能障碍起源于几种原因，其中 ETC 缺乏是一个重要的致病因素。几项案例研究表明ETC 复合体的活性或表达水平在自闭症中减少。例如，一个19个月大的具有发育退化表现的自闭症女孩有明显减少的复合体 I和Ⅲ的酶活性⁹4],另外两个患有自闭症的儿童有复合物I~Ⅲ 和辅酶Q 的缺乏95】,一个3岁的自闭症儿童患有复合体Ⅲ和IV的部分缺乏82,以及一个 12岁的患有自闭症男孩(其有5q14.3区域缺失)复合体IV的活性严重降低和在口腔拭子样品中复合物I 的活性轻度降低96]。在队列研究中，25个自闭症受试者(40%表现出不正常的功能退化)中有20个在组织中的ETC 或极谱分析中有ETC 复合体的活性缺陷[87】。复合体I,Ⅲ,Ⅱ 和IV的缺陷分别在64%, 20%,5%和4%的自闭症受试者中被观察到，而其中两个受试者具有罕见的可

300    表观遗传的，环境的和生理的因素对自闭症的影响

能是致病性的mtDNA突变87]。Giulivi等⁹报道了通过使用淋巴细胞并和对照组对比，10个自闭症儿童中的6个具有较低的复合体I 活性，4个具有较低的复合体V活性，3个具有较低的复合IV活性。另一方面，在肌肉中的复合体 IV活性被报道在一些有发育退化的自闭症病例中升高[⁹71。在一项荟萃分析中，Rossignol 和 Frye⁶ 报道了复合体I,Ⅲ,V,IV    和Ⅱ的缺乏分别存在于 53%,30%,23%,20%和9%的自闭症伴发线粒体病(MD) 的儿童中。多种复合体缺乏则在36%的自闭症/线粒体病儿童中被发现。
通过应用尸检脑组织，我们发现了自闭症儿童线粒体ETC 复合体蛋白表达水平在不同大脑区域的特异性缺失78]。相比年龄匹配的对照受试者，自闭症儿童小脑中的复合体Ⅲ和V水平，额叶皮质中的复合体I 水平，以及颞叶皮质的复合体Ⅱ,Ⅲ和V 水平都显著降低(年龄4～10岁),但这些ETC复合体在顶叶和枕叶皮质没有变化。这些结果表明，自闭症中ETC的缺陷特定于小脑，额叶和颞叶。最近，我们也报道了自闭症受试者额叶皮质中复合体 I, Ⅲ和V的活性缺陷73]。与对照组相比，自闭症组中的复合体I 和 V的活性显著减少。当对照组99%置信区间(CI)被设定为参考范围，复合体 I,Ⅲ 和V 在自闭症受试者活性下降分别为43%,29%和43%。14%的自闭症病例中所有的5个ETC复合体均显示活性减少，而29%的自闭症受试者中有多种复合体的活性减少。我们在大脑组织的研究【7支持了之前 Rossignol等68的荟萃分析结果，即复合体 I,Ⅲ 和 V 的缺陷更常见于自闭症。在颞叶皮质中， Tang等70报道了复合体I 和IV活性的降低，SOD蛋白质表达的降低以及氧化性 DNA 损伤的增加。
自闭症中的mtDNA 缺陷
在我们最近的用自闭症受试者的大脑组织进行的研究中，我们报道了增加的3个线粒体基因的拷贝数，即编码线粒体ETC复合体I 和Ⅲ亚基的ND1,ND4 和CytB。这些发现与Giulivi 等⁹¹]的研究一致，他们也报道了自闭症受试者中的淋巴细胞线粒体基因拷贝数的增加。我们的研究结果表明线粒体基因拷贝数的改变不仅发生在外周组织中，而且也发生在自闭症受试者的大脑中。氧化应激也可以增加 mtDNA拷贝数。我们还报道了在额叶皮质中的 ND4 和 Cyt B的 mtDNA 缺失在自闭症受试者中的发生率分别为44%和 33%73。Napoli 等。自闭症受试者中更高频率的GC 到 AT 转换和 GCT 到 A 的转换与他们的母亲相同71]。Pons等100报道了在一个自闭症受试者的

第16章自闭症谱系障碍的氧化应激和线粒体功能障碍    301

骨骼肌中72%的mtDNA 缺失。从两个自闭症儿童的母亲的组织中观察到了 A3243GmtDNA 突变，但这种突变并没有在这些孩子的组织中观察到100]。然而，Hadjixenofontos等[10没有发现任何证据表明mtDNA 变异在自闭症易感性中起主要作用。
Anitha等研究了自闭症受试者大脑中84个ETC基因的表达。复合体 I 的11个基因，复合体Ⅲ和复合体IV的各5个基因，和复合体V的7个基因都显示出了自闭症大脑区域特异性的表达降低。自闭症受试者的大脑区域中 ATP5A1(复合体V),ATP5G3 (复合体V) 和 NDUFA5(复合体I)基因显示出大脑各个区域一致性地的表达降低。这种ETC 基因表达缺陷可能被氧化应激诱导。他们也报道在所有检测到的大脑区域中metaxin 2(MTX2),神经纤维轻质多肽(NEFL) 和溶质载体家族25,成员27(SLC25A27) 基因的表达减少，这涉及到线粒体的多种功能76]。ATP 酶(ATPase)6和8基因由 mtDNA编码并且在能量产生中很重要。Piryaei 等102]报道称，自闭症受试者中的50%有AT- Pase6和8基因的突变，这也表明自闭症和mtDNA 变异之间的显著联系。所有这些研究提示自闭症中广泛的线粒体ETC 异常。

自闭症的维持钙稳态缺陷
线粒体发挥着维持钙稳态的关键作用，这是神经递质释放和神经元兴奋所必需的。异常的钙信号也可以影响线粒体的正常功能。线粒体天冬氨酸/ 谷氨酸载体(AGC)被钙生理性活化，它通过把谷氨酸转运至线粒体，在能量代谢和神经元发育中发挥重要作用7。 Palmieri 等。

未来方向

自闭症谱系障碍是涉及不同基因易感性与环境因素相互作用的复杂的多因素疾病。自闭症很难在两岁之前被诊断，因为诊断基于为年龄较大的儿童设计的行为测试。尽管作出了一些尝试，但目前为止我们并没有发现可以早期筛选自闭症的生物标志物。氧化应激在自闭症的发病机制中扮演重要角色，并与线粒体功能障碍，免疫异常，炎症以及环境有毒物质暴露有关联。研究发现，氧化应激和线粒体功能障碍的若干生物标志物在自闭症

302    表观遗传的，环境的和生理的因素对自闭症的影响

儿童的血液，尿液和/或脑样本中有所升高。未来研究应尝试寻找氧化应激和/或线粒体功能障碍的生物标志物，从而作为自闭症潜在的诊断或早期检测的标志物。异常的酰基肉碱谱可能是自闭症/线粒体病儿童的潜在生物标志物之一。
目前，还没有已知的药物可以治愈或治疗自闭症。改善自闭症儿童的核心行为缺陷的主要方法是早期密集的行为和教育介入治疗。自闭症治疗干预的非药物和药物靶点的发展应该是未来研究的目标。其中一种方法是识别能增强自闭症抗氧化能力和线粒体功能的药物。营养补充或维生素补充剂已被认为可减少氧化损伤和增强自闭症中的ATP 生成。Geier 等108报道了应用左旋肉碱治疗3个月显著改善了有关自闭症严重度的几项临床指标，这可能与线粒体功能的改善有关。通过增强 GSH 合成或抑制其降解改善谷胱甘肽状态的有效方法也可帮助自闭症的治疗干预。直接摄入还原性 GSH 由于吸收差，溶解度低和GSH 的稳定性低，在其他疾病中并没有效果。几个谷胱甘肽前体(N- 乙酰半胱氨酸，L-2-氧代噻唑烷-4-羧酸，γ-谷氨酰半胱氨酸)以及 GSH 类似物 YM737 已被成功开发109,10]。N-乙酰半胱氨酸也许可以提供 GSH合成所需的胱氨酸，其治疗用途处于开发阶段(Ⅱ期临床试验)¹]。一例病例报告显示自闭症儿童在应用N-乙酰半胱氨酸口服治疗后症状有所改善112。

本章要点

●氧化损伤，即脂质过氧化、蛋白质氧化和 DNA 氧化的标志物在自闭症受试者的血浆、尿液和/或尸检后的大脑组织中增加，而抗氧化防御在自闭症中减少。
●几项研究报告了自闭症中谷胱甘肽氧化还原的失衡。自闭症受试者的血液和大脑样本中GSH 的水平和GSH/GSSG 的比率降低，而GSSG 的水平增加。参与GSH 稳态的酶的活性，即GPx,GST 和 GCL,在自闭症中受损。此外，GSH,GPx 或 GST的基因多态性与自闭症有关。
● 线粒体ETC 复合体的活性和蛋白质水平或相关基因表达在自闭症受试者的血液、肌肉活组织检查或大脑组织中减少。
● 自闭症受试者的线粒体DNA 可能出现缺失、突变或拷贝数的增加。线粒体功能障碍也可能由色氨酸代谢异常引起。
总之，氧化应激和线粒体功能障碍在自闭症中发挥重要作用，需要未来的研究去了解自闭症潜在的生化机制和识别潜在的治疗靶点。

第16章自闭症谱系障碍的氧化应激和线粒体功能障碍 303

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第17章

自闭症谱系障碍中的母源自身抗体

Karen L.Jones,Judy Van de Water
宋瑞译，孔学君校

摘要
尽管自闭症谱系障碍(ASD) 的患病率在全球范围内不断升高，这种疾病的根本原因尚未确定。然而，研究报告免疫失调在一些自闭症个体以及他们的家庭成员中存在。特别是，一些研究者报道了针对胎儿大脑蛋白的IgG 抗体在一部分自闭症母亲和孩子中存在。本章我们将总结针对母源自身抗体及其在自闭症发病中的潜在作用的研究进展。在本章中，我们将探索母源自身抗体的研究现状以及在这类自闭症亚型中可能会开发出的潜在治疗策略。
关键词：母源免疫；自身抗体；胎儿大脑蛋白质；神经免疫学。

前言

自闭症谱系障碍(ASD) 是一组神经发育障碍，表现为社会互动和社交障碍，以及局限兴趣和重复行为的存在¹。目前，ASD 的患病率被认为高达 1/88²]。虽然ASD的病因未知，但遗传因素被认为在其中起到了很大的作用³。既往双胞胎研究已显示，ASD的单卵双胞胎同病率约为70%,而异卵双胞胎同病率约为5%。虽然遗传因素在ASD病因中发挥很大的作用，有证据表明环境因素也有影响。而且，最近的双胞胎研究提示自闭症易感性遗传性因素比以前设想的要少而环境性因素比以前设想的要多[6。
一个潜在的非遗传因素是免疫系统失调，这已在ASD个体以及他们的家庭成员中被屡屡报道。例如，ASD 和其家庭成员特别是母亲的自身免疫率增高明显相关。此外，产前免疫刺激如细菌或病毒感染，也与后代的行为障碍有关，包括自闭症和精神分裂症在内。自闭症的一些其他的免疫异常包括B 细胞和T 细胞的数量的减少，淋巴细胞对刺激的反应降低[12-14,单核细

312    表观遗传的，环境的和生理的因素对自闭症的影响

胞数量的增多,以及细胞因子和趋化因子的异常分布。有趣的是，研究发现ASD 儿童也存在针对不同大脑成分的抗体。本章将探讨当前研究中关于ASD的母源抗体和针对该亚型的潜在治疗方法。

免疫综述

免疫系统概述

免疫系统与身体每一个器官系统紧密联系在一起，它在不同位置有着多功能性和高度特异性。例如，在细菌密布的胃肠道中的免疫激活和无菌的血流中非常不同。
免疫系统由“先天性”和“获得性”两类组成。“先天性”免疫系统是身体防御的第一道防线。它通过识别可能是外来的以及潜在的可造成伤害的病原体的“危险”信号来迅速而非特异性地对损伤或感染做出反应。细胞如中性粒细胞、树突状细胞和巨噬细胞吞噬病原体并分泌免疫刺激分子，包括细胞因子、趋化因子和活性氧(ROS)。 “获得性”免疫系统是以高度分化的B 细胞和 T 细胞为主，它们导引针对侵入性的病原体，又称为“抗原”的特异性成分的集中而高效的反应。B 细胞在活化时产生靶标特异性的抗体，而T 细胞则执行特异性的辅助和细胞毒性功能。自然杀伤(NK)细胞是先天性免疫系统的特异性成员，通过迅速分泌细胞因子和细胞毒性分子对病毒感染和肿瘤做出反应。这些细胞在刺激获得性免疫系统、维持妊娠以及调节自身免疫反应中有额外的重要性。
母源免疫和妊娠环境
母源免疫反应会产生对妊娠环境有直接影响的因子。这些因子包括细胞因子、趋化因子和抗体，它们在妊娠期间产生，对胎儿发育有直接影响。在正常情况下，母体免疫系统在妊娠期间通过独特的调节来维持没有病原体、没有炎性因素的适宜发育下一代的环境。而胎盘提供了母亲和发育中的胎儿之间的屏障，营养和某些免疫因子被允许传送给胎儿。在这些进入胎儿的母体免疫系统成分中，免疫球蛋白G(IgG)的抗体高浓度转移大致从妊娠中期开始,是由新生儿Fc 受体介导的主动运输而跨越胎盘，导致新生儿循环中的 IgG水平超出其在母体循环中的水平。这些IgG 抗体来源于母体，为新生儿提供了针对不同病原体的被动防御机制。母体IgG 也通过哺乳期间喂母乳传递给新生儿(尽管比IgA 的水平低得多),从而使母体IgG 得以在新生儿至婴儿

第17章自闭症谱系障碍中的母源自身抗体    313

早期持续存在30]。然而，这个生理过程在特定的病理条件下也有不利的一面，如在母体患有重症肌无力时，可能会导致新生儿短暂的重症肌无力，以及在极少情况下造成先天性多重关节挛缩(一种导致后代患有严重的关节挛缩的致命障碍)31,32]。
在正常条件下，抗体无法越过血-脑屏障(BBB)进入大脑。然而，BBB 在早期大脑发育时并不完全成熟，因而致使母源抗体进入胎儿的大脑。产前暴露于结合到胎儿大脑的母源抗体被认为可以触发大脑发育异常34]。这种大脑反应性母源抗体导致的病理过程被认为通过以下3种已建立的机制之一造成：①阻断或干扰靶向分子的功能,或③诱导炎症及其在神经发育的后续影响[³7]。有趣的是，妊娠期的母体免疫激活(MIA) 和后代的自闭症有所关联10,11]。在妊娠期间，一些母体细胞因子可通过胎盘，如IL-6,或作用于胎盘细胞从而刺激下游的胎儿室中的免疫介质生成。现在已被广泛认同的观点是细胞因子参与大脑正常发育的诸多不同方面，包括神经细胞和神经胶质细胞的增殖和分化42]。但是，这些分子浓度的波动，无论是增加或减少，都可以改变神经发育的轨迹，导致后代产生大脑形态和行为的改变。

自闭症的母源自身抗体

观察性研究

Warren和他的同事们首先产生了对母源抗体和ASD 之间关联的兴趣，他们发现一些 ASD儿童的母亲在暴露于胎儿淋巴细胞抗原后引起抗体反应[43。这些母源抗体可能是通过暴露于早期妊娠和/或在分娩过程中的父源抗原而被激活，其与经刺激产生抗Rh 抗体的方式大致相同。
在一个有趣的试验性动物研究进一步确认了ASD 和母源抗体之间的关联后,多项研究将这个早期的研究扩展，从而更全面地鉴定这些抗体。Braun- schweig等通过应用一个大型的特征性病例对照队列的样本，证明了ASD儿童的母亲(11.5%)血浆中存在针对胎儿大脑蛋白(37kDa 和 7 3kDa) 的抗体反应，但正常发育儿童的母亲完全没有(0)。Zimmerman 等的一项类似的试验性研究观察了11名ASD儿童的母亲和10名正常发育儿童的母亲，检查了母体血清对大鼠来源的产前、产后和成年鼠大脑蛋白质的自身抗体反应。实验显示了ASD儿童母亲的血清对胎鼠大脑组织的反应，而对照组母亲的血清却没有反应。此外，这种抗体反应并未在产后或成年大鼠大脑中被观察到，并且免疫印迹表明，鼠胎大脑反应性并不是针对之前确定的自身免疫的神经

314                表观遗传的，环境的和生理的因素对自闭症的影响

元靶点。
在这些发现之后，一个稍大的样本试验中召集了100名自闭症儿童的母亲和100名正常发育儿童的母亲，测定了她们针对人类和啮齿类动物胎儿大脑组织的血清自身抗体的反应性。此外，对于针对人类胎儿大脑组织39kDa 蛋白质以及啮齿类动物胎儿大脑组织73kDa蛋白质的母体反应性，自闭症儿童母亲的血清也大于对照组母亲的血清。有趣的是，Braunschweig 和 Singer 的研究都观察到针对胎儿大脑组织的母体反应性与育有退化性自闭症的孩子有着显著关联。两项研究在条带上的轻微差异可能是由于应用了不同的组织和免疫印迹(Westernblot) 的不同方法来分析的结果。
最近研究人员已证实，根据迄今为止的大型队列研究报告，自闭症儿童的母亲较对照组母亲存在抗大脑抗体的概率明显增加。此外，对大脑蛋白有反应性的ASD 母亲也更可能存在抗核抗体，以及患有一种自身免疫性疾病，这表明这些大脑反应性抗体可能与自身免疫有关。然而，需要注意的是，在这项研究中，经免疫印迹方法鉴定的蛋白质条带是可变的，因此作者未能对特定条带的反应性发表评论。
针对母源胎儿大脑反应性抗体和自闭症的关联性研究的一种核心批评意见是标本采集通常会发生在一个孩子已诊断后，因而我们并不清楚采集过程中存在的抗体是否在怀孕时就存在。为了解决这个问题，一项大型的采集孕中期血液标本的病例对照研究筛查了对胎儿大脑的反应性。患有自闭症儿童的母亲在妊娠期存在母源胎儿大脑反应性抗体在这项研究中被证实，特别是针对39kDa 和73kDa条带的反应。
Braunschweig等为扩展以前的研究结果，在随后的研究中观察了另外的 560名自闭症儿童的母亲与正常神经发育对照组的母亲，测量针对来源于恒河猴的胎儿大脑蛋白质的母源抗体反应50]。这项研究结果与先前的观察是一致的，针对37kDa 和73kDa 条带都有的母源反应性与儿童的自闭症诊断显著相关，针对37kDa/73kDa 条带共同的反应性在自闭症儿童母亲中独有，对照组母亲则不然。有趣的是，免疫技术的改进令我们观察到了在约39kDa 处的另一个免疫反应条带。针对39kDa 和73kDa 的共同反应被发现与更广泛的ASD 诊断紧密相关。行为测试结果表明，母亲对37kDa 和73kDa 条带有反应性的 ASD 儿童有着显著受损的语言表达功能，而母亲对39kDa 和73kDa 条带有反应性的ASD儿童有着增加的烦躁分数。最近的研究发现，对37kDa/73kDa条带配对有反应性的母亲所生的男性ASD 儿童相比于正常发育儿童和无37/ 73反应ASD男性儿童具有更显著的大脑增大。这些结果表明，针对胎儿

第17章自闭症谱系障碍中的母源自身抗体    315

大脑蛋白质的母源自身抗体反应性可能在一部分儿童的ASD病理发展中发挥作用。
由于上述研究强有力地表明了母源抗体在ASD 病因中的作用，鉴定母源自身抗体相关(MAR) 自闭症的靶抗原便成为了推动自闭症研究在这一领域的关键一步。Braunschweig和他的同事的在此领域的第一项研究成功确定了几种靶向胎儿大脑组织可能的抗原蛋白质[⁵2]。对胎儿大脑有反应的母源血浆样本随后被用于蛋白质组抗原识别。通过串联质谱法肽测序，自身抗原(或目标蛋白)分别被确定为：乳酸脱氢酶(LDH)A和 B, 鸟嘌呤脱氨酶(cypin), 应激诱导的磷蛋白1(STIP1),脑衰蛋白反应调节蛋白(CRMP)1 和2,和Y 框结合蛋白1(YBX1)⁵2] 。最初的37kDa 抗原被发现是LDH A 和 LDHB,39kDa抗原是YBX1,上部和下部73kDa抗原分别是STIP1和 CRMP1,而之前研究没有指出的44kDa蛋白是鸟嘌呤脱氨酶。母体的针对其中任何抗原的反应性，单一或复合的，都与孩子最终患有 ASD 具有高度显著关联，优势比(odds ratio)为3.26。最常见的反应模式是LDH/STIP1/CRMP1 组合(5% ASD 母亲对比0%对照组母亲),另外还有几个其他的模式只有在ASD儿童的母亲中发现而非对照组中。此外，在母亲具有针对LDH,CRMP1,LDH 和 STIP1 组合，或 LDH/STIP1/CRMP1的抗体反应活性的儿童中观察到了相较于无反应母亲的 ASD儿童所增加的刻板行为。此外，当综合所有的抗原模式，共有近23%的自闭症儿童的母亲拥有某一种含两个或两个以上靶蛋白的ASD 特异性自身抗体模式，而对照组母亲只有1%。有趣的是，每个被识别的自身抗原都在人类胎儿大脑中呈现显著的水平，并确实在神经发育中发挥作用。因此，对于在发育中的大脑中高度表达的这些蛋白质的特异性IgG 反应性的识别，进一步支持了母源自身抗体在ASD 亚型病因中的潜在作用。

动物模型
虽然观察性研究确切地揭示了胎儿大脑蛋白质反应性母源抗体和自闭症的关联，这些抗体是否直接引起自闭症，这在伦理上无法通过人类受试者证明。因此各种动物模型研究开始进行，以积累对于这一假说的支持依据。在早期的试验性研究中，将一个自闭症儿童母亲的血浆注入了妊娠小鼠，导致其产生的后代探索行为和运动协调的改变【4]。在另外一个小鼠模型中，妊娠小鼠在胚胎13～18天被注入自闭症儿童母亲或对照组母亲的IgG³7] 。暴露于自闭症母源IgG 的后代较之对照组后代呈现出行为异常，包括增加的焦虑样行为、多动、对听觉刺激显示更大幅度的受惊反应，和受损的社会互动功能[37J。
最近的研究检测了这样的小鼠模型，在其妊娠期静脉注射一剂纯化的

316    表观遗传的，环境的和生理的因素对自闭症的影响

ASD儿童母亲的同时针对37kDa 和73kDa 胎儿大脑抗原的IgG 抗体或对照组母亲的IgG⁵3] 。注射的人IgG 在鼠胎大脑和肝中检测出相对最高的浓度，支持母源IgG 与胎儿的大脑发育直接相互作用的机制。暴露于母源37kDa/ 73kDa条带阳性IgG的后代显示出断奶前期的运动和感觉发育较慢。此外，少年期后代的行为测试显示，这些后代较对照组后代表现出社会行为改变和焦虑样行为5³3。在最近的一项旨在检验母源抗体对神经元发育的直接影响的研究中，研究人员给予妊娠中期的胚胎小鼠侧脑室内注射纯化的37/73反应性 ASD 母亲的IgG 或对照组母亲的IgG。暴露在ASD母源自身抗体的鼠胎大脑较对照组显示出脑室下区胚胎大脑皮质的增生，大脑的体积和重量的增加，皮层神经元的增大，以及刻板和社会行为的改变。这些模型中的每个结果都表明了孕期暴露于37kDa 和73kDa条带反应性母源IgG 产生了对后代的生理和行为的影响，进一步支持了这些母源抗体在ASD 病因中的作用。
虽然学习ASD小鼠模型有许多益处，但ASD的核心症状很难在这样的模型系统中评估。相比之下，非人类的灵长类动物模型提供了独特而可观的优势，因为它们表现出许多小鼠模型不能完全囊括的人体生理学、解剖学和行为特点。在第一个非人类灵长类动物的自闭症母源抗体研究中，Martin 等给怀孕恒河猴在妊娠期间分3次静脉注射了从ASD 儿童母亲或对照组母亲中提取的纯化混合型IgG⁵5 。虽然妊娠期暴露于ASD母源抗体没有造成后代的任何社会行为的显著差异，但这些后代相较暴露于对照组IgG 的动物表现出了多动和戏剧性的全身性刻板，例如重复的后空翻和踱步。
在后续研究中，怀孕的恒河猴被注射了自闭症儿童母亲的37kDa 和 73kDa 胎儿大脑蛋白反应特异性抗体的纯化IgG 或对照组母亲的IgG⁵6] 。在分析后代的行为时，产前暴露于37kDa/73kDa 抗体的猴子相较于对照组后代显示出异常的社会行为。为了研究暴露后代大脑发育的潜在变化，这些后代尤其是雄性后代进行了纵向磁共振成像(MRI)。在其两岁时，暴露于37kDa/ 73kDa 抗体的雄性后代和对照组雄性后代相比具有全脑、额叶和枕叶体积的明显增大。进一步的发现表明这些后代相较于对照组后代的总白质体积明显增加。这些结果与之前描述过的其母具有37kDa/73kDa 蛋白反应性抗体的男性患儿的大脑状态相呼应。
经母源自身抗体相关自闭症谱系障碍(MARASD)的小鼠和非人灵长类动物模型的自闭症表型研究表明，这些母源抗体在 ASD 的病理中发挥作用。这些抗体如何产生，以及它们通过什么样的机制干扰神经系统发育尚未被阐明。这些母源抗体结合到胎儿大脑蛋白质很可能直接导致神经发育的改变，同时母源抗体也可能被用作细胞破坏的生物标志物。尽管缺乏 MARASD 机理性的动物研究，目前的动物模型仍然提供了可观的结论来进一步支持这些

第17章自闭症谱系障碍中的母源自身抗体 317

抗体在ASD 病因中的作用。
母源抗体和遗传易感性
遗传学被认为在ASD的病因中发挥了很大的作用，与免疫功能相关的一些遗传多态性可能作用于母源抗体产生的潜在机制。其中一个遗传风险因子是酪氨酸激酶MET受体的功能性多态性。 MET除了在大脑发育和胃肠道修复中扮演的角色外，还是免疫反应的关键调节者，并以剂量依赖效应的方式影响了自身耐受S⁷,58]。一些独立的基因研究中已发现 MET基因5'启动子的功能性变异体在与ASD 显著相关。这种变异体，rs1858830,是一种常见的 G 到 C 单核苷酸多态性(SNP);在ASD中，“C” 等位基因在ASD个体中被遗传的概率大于预测概率，并且相较于一般人群更常见于ASD个体。Heuer 等在最近的一项研究中发现，与对照组母亲相比，“C” 等位基因与自闭症儿童母亲的针对胎儿大脑蛋白质的母源自身抗体的存在显著相关63]。此外，作者还发现该“C” 等位基因与降低的MET蛋白表达和降低的IL-10 水平有关63]。IL- 10这种免疫抑制细胞因子的减少可能会导致母体免疫耐受的损坏，从而容易产生自身抗体。目前，并没有其他的研究阐明这些 ASD 特异性母源抗体与遗传风险因子之间的关系。

未来方向

虽然看起来胎儿大脑蛋白质反应性母源抗体在一组ASD 亚型的病因中发挥作用，该领域仍需进一步研究。例如，虽然发现了特异性靶蛋白是很有前景的，但仍需要研究来验证针对这些蛋白的母体抗体的真实发病率以及它们与 ASD的相关性。另外，进一步的动物实验是必要的，以便更好地理解针对这些蛋白质的母源自身抗体反应是否在其后代中产生和ASD个体相似的行为和生理变化。这些研究也将会让研究人员探查母源自身抗体及其相关ASD 的机制，从而指导研发这一 ASD亚型的靶向治疗。
不幸的是，目前尚无MARASD可用的生物疗法。但是在研发抗体抑制疗法之前，需要制定基于抗体的筛查方法，从而使有这些反应性抗体的女性得以被识别和检出。虽然目前尚不能确定这些母源抗体是否直接介导病理过程， MARASD的动物实验研究表明它们是具有病理意义的，这在上面已有讨论。因此，理想的疗法可能可以阻止这些病理性抗体到达胎儿。为了防止它们接触到胎儿，抗体可能已被特异性或非特异性地从循环中去除。虽然开发MAR ASD的疗法仍有很长一段路要走，我们希望通过详尽的临床研究，深入理解与这些抗体相关的病理机制，设立临床相关的动物模型，从而开发靶向治疗达到

318                表观遗传的，环境的和生理的因素对自闭症的影响最终目标。
结论

总之，大量研究支持胎儿大脑蛋白反应性母源自身抗体在ASD 亚型病因中的作用(表17-1)。此外，这些抗体似乎针对36～39kDa和73kDa蛋白有特异性反应，研究人员初步确定这些蛋白质作为 LDH A 和 LDHB,STIP1, CRMP1和 CRMP2,鸟嘌呤脱氨酶(cypin),以及YBX1。然而，未来进一步的实验是必要的，以确定这些抗体是否在MARASD的发病中起直接作用，以及通过它们的行为表现阐明其潜在机制。了解这些抗体潜在的致病作用对于开发此ASD 亚型的治疗策略至关重要。
表17-1与自闭症母源抗体相关的观察性和行为性研究的结果汇编

靶抗体研究描述发表年份
观察性研究
儿童/父母的淋巴细胞[433 ASD患者的母亲表现出对她们的ASD孩子的淋巴细胞增加的抗体反应
1990
大鼠胎儿/青少年/ 成年大脑 ASD患者的母亲表现有针对鼠胎大脑蛋白质的 IgG反应性
2007

人类胎儿大脑[451 ASD患者母亲的血浆中有针对人胎脑37kDa和 73kDa蛋白的IgG反应性，对照组母亲则不然
2007
胎儿/成年人类和大鼠大脑47J ASD患者的母亲被证实有针对人胎脑36kDa, 39kDa和73kDa蛋白质的IgG反应性
2008
ASD患者的母亲孕中期血清中有针对人胎脑
人类胎儿大脑49 39kDa和73kDa蛋白质增加的IgG的反应性，对照组母亲的血清则不然 2008
小鼠胎儿/成年大脑[43 ASD患者的母亲被证实有针对胎儿大脑抗体以及抗核抗体的IgG反应性，对照组母亲则不然
2013
胎儿人类/猴脑 AU和ASD患者的母亲被证实有针对胎儿大脑蛋
白质的IgG反应性，分别在37kDa/73kDa(AU母亲)和39kDa/73kDa(ASD母亲) 2012
针对胎儿大脑37kDa/73kDa蛋白质有反应性的
胎儿猴脑[63 ASD患者的母亲相较于无反应性ASD母亲和对照组母亲更经常继承MET启动子C等位基因的功能变体 2011

第17章自闭症谱系障碍中的母源自身抗体    319

续表

靶抗体
研究描述                发表年份

胎儿猴脑母亲有针对37kDa/73kDa胎儿大脑蛋白反应性的男性ASD儿童相较于对照组儿童具有更极端的大脑增大

2013

胎儿猴脑已被报道的被识别出的胎儿大脑蛋白质有：LDH
A和LDH B,cypin,STIP1,YBX1以及CRMP 1和2013 CRMP2

物种
研究描述                发表年份
动物模型

小鼠443 将ASD患者的母亲血清注射到怀孕小鼠体内，其
产生的后代相较对照组有探索行为和运动协调2003 的改变

小鼠371 妊娠小鼠被注射了ASD患者的母亲或对照组母亲的IgG,暴露于ASD IgG的后代展示了多种自闭症样行为，对照组后代则不然

2009

怀孕恒河猴553 将ASD患者或对照组受试者的母亲的纯化混合IgG注入怀孕恒河猴，暴露于ASD IgG的后代在社会和刻板行为方面表现出明显的不同

2008

小鼠53 妊娠小鼠被注射了来自针对胎儿大脑37kDa/73kDa蛋白质有反应性的ASD患者母亲和对照组母亲的纯化IgG,37kDa/73kDa IgG组的后代表现出运动和感觉发育的受损以及社会行为和焦虑行为的改变

2012

小鼠54] 37kDa/73kDa ASD母亲或对照组母亲的纯化IgG 注入了妊娠期小鼠胚胎的脑室，出生前暴露于 ASD母源抗体的后代和对照组相比表现出大脑形态和行为的变化

2013
注：ASD-自闭症谱系障碍，AU-自闭症，IgG-免疫球蛋白G

本章要点

●免疫失调存在于ASD 个体以及他们的家庭成员中。
●针对胎儿大脑蛋白的反应性母源抗体的孕期暴露可能与某些自闭症病例相关。

320    表观遗传的，环境的和生理的因素对自闭症的影响

●虽然母体产生这些抗体的确切原因尚不确定，研究表明，遗传易感性因素可能与抗大脑抗体联合导致了后代ASD 的产生。
●有关自闭症中母体抗体的确切机制尚不明确，是现在一个活跃的研究领域。

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第18章

为什么自闭症在男性较为普遍?

Simon Baron-Cohen,Michael V.Lombardo,Bonnie
Auyeung,Emma Ashwin,Bhismadev Chakrabarti,
Rebecca Knickmeyer
宋瑞译，孔学君校

摘要
自闭症谱系病症(ASC) 在男性中更为常见，这一现象可能提供了此病症的病因线索。我们认为这是因为ASC是男性大脑的极端表现。极端男性大脑 (EMB) 理论于1997年首次提出，是典型的关于性别差异的共情-系统化(E-S) 理论的一个扩展，该理论指出女性平均具有较强的共情能力，而男性平均有较强的系统化能力。在这章中，我们介绍了一些有关ASC EMB理论的证据，并研究大脑结构中典型的性别差异如何与ASC形成可能相关。一种造成男性偏差的可能生物学机制是胎儿睾酮(fT)的效果。支持 fT 理论的证据权重随着资料汇总而增长(根据fT 水平进行的从妊娠期到10岁的纵向研究、羊水测定、目前激素的研究、参与性激素生物合成途径的基因多态性 SNPs 相关研究)。与丹麦生物库的大型合作研究具有足够的效力检验fT 理论，看看fT 以及在△4途径中相关的胎儿类固醇水平是不是在日后发展为ASC儿童的体内升高。
关键词：性别偏差；极端男性大脑(EMB) 理论；共情-系统化(ES) 理论；胎儿睾酮；羊水；性激素；性类固醇的生物合成途径；胎儿雄激素；人脑中的两性异形。

自闭症中的男性偏差

经典的自闭症和阿斯伯格综合征(AS)的诊断被称为自闭症谱系病症 (ASC),其依据为社会互动和沟通的困难，以及高度重复性的行为和异常局限

第18章为什么自闭症在男性较为普遍?    327
性的兴趣1。 ASC 的患病率约为1%。ASC也是遗传性的5,6,虽然需与环境互相影响。ASC强烈偏向男性⁷,经典自闭症的男女比例为4:18,而 AS 个体的男女比例高达11:1⁹。ASC中男性更高发的具体因素尚不清楚。 ASC 不是唯一的在男性中较常见的神经发育病症 — — 在注意缺陷多动障碍 (ADHD)、阅读障碍、行为障碍(CD) 、特定的语言障碍、抽动秽语综合征和学习困难中也有男性患病率高于女性的情况10]。然而，男性偏差在ASC 更显著,特别是AS。
这种男性偏差可能只是反映了女性诊断AS的难度。虽然经典自闭症在女性不会被误诊，但AS的诊断在女性有被忽略的可能，如果它表现为一些其他病症，如厌食11或边缘型人格障碍¹2,这两者都包括了对环境和他人的过度控制欲以及一定程度的自我中心。同样的，如果女性更有动力去学习适应社会或有更好的模仿技巧让她们“假装是正常的”,那么女性的AS 可能会被漏诊。最后，广泛使用的诊断工具[自闭症诊断观察附表(ADOS) 或自闭症面谈诊断-修订版(ADI-R)] 无法检测出女性 AS 患者可能具有更微妙的表现方式，这也会反映到男性偏差上面。
虽然对于女性的误诊和漏诊的解释可以部分说明男性偏差，但也可能还有一些生物学的原因可以解释ASC的男性偏差。我们认为，这些偏差可以被理解为男性大脑心理和生理属性的一种极端表达；也就是说，男性只需要轻微的心理和生理上的变化就可表现出ASC,而女性则需要更多，因此使得ASC在女性中更少见。哪些因素可能偏向于男性特点的过度发展呢?一种可能的生物机制可能是胎儿睾酮(fT)的男性化效果。在这里，我们列出了一些解释 ASC男性偏差理论的证据。

ASC 是男性大脑的极端表现吗?

极端男性大脑(EMB) 自闭症理论延伸了典型性别差异的共情-系统化 (ES) 理论¹4,该理论提出女性平均具有较强的共情能力(识别别人的思想和情感并用恰当的情绪回应),而男性平均有较强的系统化能力(分析和构建以规则为基础的系统)。虽然社会学家还在争论是否真的有性别差异，如果是这样，这是否是纯粹的文化背景带来的结果，生物学家早就从有关行为的性别差异的动物研究中得知，所有的灵长类动物都有这种差异，并且其受到生物学基础及环境的影响。对于共情商数(EQ)15, 一般女性得分高于男性，而男性得分高于ASC患者。在系统化商数(SQ) 上，ASC个体得分高于一般男性，而

328    表观遗传的，环境的和生理的因素对自闭症的影响

男性得分高于一般女性。其他心理学证据表明(表18-1)——不考虑性别差异的方向——自闭症人群都表现出极端的男性特征。需要注意的是EMB 理论并没有说所有的心理上的性别差异都在ASC中被夸大——只有那些与共情和系统化相关的方面。
表18-1极端男性                大脑(EMB)理论心理学证据总结

心理测评自闭症>男>女女>男>自闭症关键参考文献
青少年AQ √
成人自闭症商数(AQ) √
成人系统化商(SQ) √
儿童AQ √
儿童SQ √
儿童自闭症测试(CAST) √
镶嵌图形测验 √
直观的物理测试 √
社会反应量表 √
幼儿自闭症定量检查表(Q-CHAT) V
成人共情商数(EQ) √
儿童EQ √
失言测试 √
友谊与关系问卷(FQ) √
从眼神读心 √
社交故事问卷(SSQ) √

人类大脑中的两性异形

对 ASC的 EMB 理论的其他支持来自于神经两性发育差异的证据。一些关键的典型两性异形的例子揭示了ASC神经发育的典型极端化男性特征。但是，应铭记在心的告诫是，自闭症的极端男性特点并不包括所有心理上的性别差异，也不包括所有神经上的性别差异。事实上，鉴于EMB 理论定义在心理层面，我们应该认识到ASC的男性化只涉及小部分的神经性别差异。支持这一预测的一个关键发现是，平均而言，男性婴儿比女性[20大脑体积要大，并

第18章为什么自闭症在男性较为普遍? 329

且自闭症儿童的大脑体积会更大，通常在其确诊期会发现这个现象(2～4 岁)。此外，除了整个大脑尺寸的差异，一般男性的杏仁核也趋于比女性大22,而在发育早期，自闭症患者的杏仁核比一般男性更大。除了这种大脑结构性的两性异形，大脑功能的两性异形也显而易见，据此证实了EMB 理论的预测(更充分的讨论见表18-2)。
表18-2神经层面                与EMB理论一致的证       据总结

大脑区域自闭症 >男>女女>男> 自闭症
关键参考文献
结构
总脑容量 √
杏仁核 √
胼胝体 √
外侧裂周区语言区(颞横回/颞平面) √
左侧大于右侧颞平面不对称性 √
外侧额顶叶皮层
功能 V
默认模式网络连接性 √
镶嵌图形功能磁共振成像(fMRI) √
功能磁共振成像监测从眼神读心的任务
√

ASC超男性化的惊人发现，同时发生在3个水平(认知、神经解剖和神经功能),那么到底哪些生物学机制涉及其中就是个问题。在大脑、认知和行为各个层面所产生的两性异形、超男性化、和/或缺乏典型两性异形的机制似乎是胎儿睾酮(fT)“安排”的结果30-32]。我们回顾这个有趣的假设，我们不建议把它作为一个对于ASC 的全面解释，因为ASC 是多因素的，但是它可以作为解释此病症的一个重要部分。

胎儿睾酮(fT)理论

胎儿雄激素影响大脑：动物和人类研究的证据
动物研究，尤其是在啮齿类动物中，确认了早期雄激素(例如睾酮)作用在

大脑产生行为、认知、大脑结构和功能的性别差异。被广泛认可的观点是 fT也影响了人类大脑的发育和行为。人类男胎在妊娠8～24周会经历fT 的第一次激增,一直持续到青春期的第3次激增。第3次激增被认为是控制了青春期的开始，而第一次激增(fT)被认为是控制了大脑的男性化。已在动物实验中实行的针对激素的直接操纵在人类胎儿和婴幼儿使用无疑是不道德的，可替代研究方法包括检测羊水fT 含量的个体差异与之后的发育影响[383,对于因为某种医学原因致使性激素比预期更高或更低的人群的研究³9,和应用fT 曝光的替代措施。在这里，我们回顾了与ASC 相关认知特质的研究证据以及它们与羊水fT 的关系。
胎儿雄激素影响ASC 特质：来自羊水睾酮的证据
fT 可以在羊水中进行测定，在常规羊膜穿刺术中获得。由于羊膜穿刺术通常在妊娠中期(通常孕14～20周)进行，正值男性胎儿血清睾酮达到峰值，它提供了一个独特的将fT 与 ASC 特质相比较的机会。羊水中的雄激素水平被证明有很大的性别差异。羊水中雄激素的来源看起来是胎儿本身，在羊水获得的睾酮被认为是fT 水平的良好反映38]。在由我们课题组1998年发起的剑桥胎儿睾酮项目中，母亲在怀孕期间有羊膜穿刺术的儿童(但他们发育正常)在出生后每一年或两年被持续随访，现在他们大约是11岁。
有证据表明羊水的fT 影响了正常发育儿童(但明确关联到ASC) 认知发展的个体差异，包括以下：fT 与儿童12个月月龄时、96月龄时的“系统化”[18,以及96月龄时测定细致观察力的内嵌性能图测试(EFT)的表现50呈正相关。这些都是显示两性异形的行为，但关键是，这些fT 的效果往往在一种性别中和合并性别分析后均被发现。 fT 与社会领域的一致反相关性以及其与非社会领域的一致正相关性贯穿发育过程，这是惊人的，并提示fT 在发育中真的扮演了“组织性”的角色。
在第一项直接评估fT 不只影响人类认知还有人类大脑结构的研究中，我们发现增加的fT 水平与胼胝体峡部厚度增加的向右不对称性相关联⁵¹。这个发现很有意思，因为峡部伸向整合语言和视觉空间能力的后顶叶及上颞皮层，它们被认为在偏侧化、结构和功能上有着两性异形。我们还发现，fT 预测了右颞顶叶交界(RTPJ) 处、右颞平面/顶岛盖，和眶额皮质后外侧的局部脑容

第18章为什么自闭症在男性较为普遍?    331

量。这些区域在一项个体年龄相匹配的独立队列研究中均发现了两性异形，并且正如预测的那样，它们与fT 的相关性的指向与两性异形的指向相同(例如，fT和 RTPJ 的正相关性和男性>女性的两性异形)²]。这是第一个研究证实 fT 对人类大脑结构的性别差异就像在非人类物种中的研究那样，也有真正的长期的影响。在功能上，这些区域对自闭症和其他的心理发育疾患非常重要，因为它们都涉及认知领域，如心智化能力/度人之心能力、语言和自我调节能力。进一步直接分析 fT 对人类大脑功能的影响，通过功能性磁共振成像 (fMRI) 我们还发现，增加的fT 预示了奖励系统(如纹状体)对正性有效刺激反应的选择性的增加，较之负性刺激而言。此外，fT 对增强奖励系统对正性刺激灵敏度的影响介导了fT 对行为取向(冒险、冲动、对于奖励的敏感度)的影响，这是通过奖惩敏感性问卷测量而得知。因此，除了与自闭症表型相关外，fT对人类大脑功能的影响也延伸到神经敏感性以及很多其他神经精神病症相关的表型，它们呈现性别不对称性、奖励系统功能的异常以及极端的行为取向。
所有上述的行为领域(眼神对视、语言发展、社交质量、局限兴趣、共情、系统化和镶嵌图像/注重细节)和大脑结构上显示出两性异形并呈现出 ASC的超男性化，提示了fT 在 ASC自身发展中发挥作用的可能性。三项最近的实验确认了的fT 水平和学步期及学龄前期[55儿童自闭症特质数量之间的正相关性。
在本章中，我们有相当数量的研究提示 fT 作用于一般人群行为和认知的关键领域(社交发展、语言发展、共情、系统化和注重细节)性别差异，也影响大脑结构，和个体所具有的自闭症特征数量。理解共情能力和系统化能力的关系需要更多的研究，因为我们常常把它们当作独立的指标而忽略了它们都与 fT相关的事实。我们也还不能将fT 用作ASC 的诊断指标，因为这将需要收集更多的羊水样本，迄今为止它们是不够的。最新遗传学证据增强了fT 在 ASC中的作用，那就是性激素关键基因的SNP 与确诊的AS 和/或自闭症特质相关。

未来方向

剑桥胎儿睾酮项目中的儿童的样本数目(目前只有635名)对于测试fT 是否在之后诊断为ASC 的个体中升高的实验来说还太少。但通过我们与丹麦生物库正在进行的合作，检测fT 水平和确诊的ASC 之间的直接关联将成为可能，因为它有数以万计的羊水样本，有足够的效力来检验这一假说。通过使用不同方面的证据，一些研究也发现了ASC 患者或其家属当前雄激素的失调，或雄激素相关基因与ASC 的相关性(见表18-3,fT/雄激素理论证据的总结)。尽管有些研究未能支持睾酮在ASC中的作用(大部分的这些研究都没能特异性

332    表观遗传的，环境的和生理的因素对自闭症的影响

地研究fT), 上述报告的研究表明fT 与 ASC中观察到的性别差异相关。最后，虽然精神病学分类系统界定清晰，但有可能一些潜在的激素和遗传方面的机制不仅牵涉 ASC,还与更广泛类别的神经发育病症有关。
表18-3自闭症性激素效应的证据
证据关键参考文献
从正常发育儿童
眼神对视与胎儿睾酮(fT)负相关
人际关系的质量与fT负相关
词汇量与fT负相关
共情与fT负相关
自闭症特质与fT正相关
局限兴趣与fT正相关
系统化与fT正相关
胼胝体峡部向右不对称性与fT正相关
大脑区域两性异形的变化通过fT预测
奖励系统灵敏度和行为方法取向的变异通过fT预测
从自闭症谱系病症(ASC)人群
10个基因参与性激素的合成，运输，和/或与阿斯伯格综合征(AS)或自
闭症商数(AQ)或共情相关的代谢： HSD11BI,LHCGR,CYP17AI, CYP19A1,SCP2,CYP11BI,ESRI,ESR2,HSD17B4,HSD17B2
青春期的时机：患有ASC的男孩进入青春期更早。患有ASC的女孩进入青春期更晚

患有ASC的女性及其母亲的睾酮有关的医学病症如多囊卵巢综合征(PCOS),乳腺癌和卵巢癌，痤疮)

患有ASC的女性及其母亲的睾酮相关的特征
ASC及其父母，低2D:4D值
SRD5A1和AR基因与ASC相关
尸检额叶和小脑组织中RORA基因和芳香化酶的表达减少
先天性肾上腺皮质增生症(CAH)女性有升高的AQ
ASC的睾酮水平升高
ASC的雄烯二酮水平升高

第18章为什么自闭症在男性较为普遍?    333

本章要点

● 自闭症谱系病症(ASC) 更常见于男性。
· 一般女性平均有较强的共情能力，一般男性平均有更强的系统化能力。
● ASC 人群似乎符合典型男性认知特征的极端状态：低于平均水平的共情能力和完整的或平均水平以上的系统化能力。
● 胎儿睾酮(fT) 与共情、系统化和自闭症特质的个体差异相关联。
●与丹麦生物样本库的大型合作研究具有恰当的效力去测试fT(以及在△4 途径上的相关的胎儿类固醇)是否在日后发展为ASC 的儿童中升高。

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ASD 的个性化治疗和一生不同阶段的议题

第19章

自闭症谱系障碍的精神药理学的未来导向

Deepali Mankad,Evdokia Anagnostou 曹瑾孔健译，董存建孔学君校

摘要
自闭症谱系障碍(ASD) 是一种神经发育障碍，其特征是社会沟通障碍和重复行为/兴趣局限。目前治疗方法的开发是基于表型谱显示神经生物谱这一假设，因此，针对治疗相似重叠症状的药物被批准在ASD的治疗中使用。这个方法并非完全无效，但尚未发现针对其核心症状的药物。随着对ASD 基础神经科学认识的逐步深入，人们试图确定适用于药理学干预核心症状的多种大脑通路和分子靶点。在本章中，我们将对这些潜在通路及具有前景的干预方法进行综述。
关键词：自闭症谱系障碍；精神药理学；催产素；免疫系统紊乱；突触功能障碍。

前言

自闭症谱系障碍(ASD) 是指以社会沟通障碍和重复行为为特征的一系列神经发育障碍。“自闭症(autism)” 一词来自希腊词“autos”, 意思是“自我(self)” 。这个词在1943年被LeoKanner用来描述儿童有限的互动，即，一个孤立的自我1。社会沟通障碍和重复行为这两个特征已得到了广泛描述2]。社会沟通障碍包括基本社会认知过程的缺陷，如眼神交流、识别面孔和情绪、度人之心[注：theory of mind 确切的翻译是：度人之心，而不是共情(empathy)]    的能力以及社会情感互动的困难，而最终难以发展适龄的同伴关系。对生日录像记录的回顾性研究和系统性综述表明，患儿早在12个月龄时就会表现出

346    ASD 的个性化治疗和一生不同阶段的议题
眼神交流、注意力和模仿行为的异常L³,4]。局限兴趣和重复行为共同构成了 ASD 诊断的第二大类症状。孩子2岁时重复行为的严重程度预示着其在9岁时是否符合自闭症的诊断标准5。
自闭症的治疗一直受制于缺乏分子靶点的困扰。在ASD的药物试验中，大多数药物是基于它们可能对具有相似重叠症状的另一种精神/神经发育障碍有效这一事实进行选择的。这种方法在治疗相关症状上取得了一些成效，如改善易怒症状的利培酮(risperidone)和阿立哌唑(aripiprazole)⁶,    但尚未研制出针对其核心症状领域的药物。随着ASD 神经科学发展的日趋成熟，基于ASD病理生理学相关靶标的新方法开始呈现。然而仍存在一些挑战。基因组研究的结果质疑了常见疾病-常见变异模型，而支持常见疾病/罕见变异模型，这表明ASD不仅具有表型多样性，还有生物多样性7。因此，一种治疗不能适用于所有情况。
目前提出以下几种方法来解决这个问题：
①深入对生物标志物的发掘，以促进对病人群体分层从而找出更有可能对治疗有反应的群体进入临床试验。
②将ASD最新的神经生物学发现转化为治本的新疗法。
③解读来自系统神经科学所识别的靶向系统的依据，他们或许不直接参与ASD 的病理生理学改变，但有可能改变其核心和相关症状的严重程度。
④将针对ASD 生物学机制的药物治疗与现有的和新兴的心理教育干预相结合以促进(社交)技能的获取。

基于生物标记物的分层

据所使用的方法学显示，高达40%的ASD 患者携带一个罕见的基因突变8。目前，已试图通过几种聚类分析表明，涉及的几个基因映射到突触形成和突触可塑性，神经元移动性和轴突定向⁹。如神经连接蛋白家族对抑制性和兴奋性突触以及编码突触支架蛋白SHANK3 的形成和巩固是非常重要的。这些基因的变化可能会影响大脑的兴奋抑制率，这一事实揭示了治疗的一个潜在靶点，将在后文进行讨论。
然而，参与研究的大部分受试者尚没有可用的基因组信息。这需要下游的生物标志物协助区分没有已知突变的患者。尽管证实这种方法具有可行性的研究仍然在进行中，除了详细的表型外，目前已经提出具有前景的基因表达研究、成像、蛋白质组学/代谢组学用于该研究。正在开发跨物种平台将已知的动物模型的神经生物学知识转化到人类，并探索“诱导多能干细胞”(iPS cells)作为直接用于测试药物对患者细胞产生的细胞生物学效应的潜在系统。

第19章自闭症谱系障碍的精神药理学的未来导向 347

有关此类举措的示例，请访问www.eu-aims.com 和 pond-network.ca参阅。

针对ASD 的最新病理生理机制的药物

我们选择从基因组学/蛋白质组学和神经病理学两个领域的发现进行讨论。这绝不只是一个详尽的罗列，更意在说明这个过程。
改变兴奋-抑制(excitation to inhibition,E:I)平衡的药物

如前所述，一些罕见的基因突变共存于负责谷氨酸能(glutamatergic)和γ- 氨基丁酸能(GABAergic) 突触形成和突触可塑性的信号通路里，这表明E:I平衡被打乱。这种现象在CNV 数据出现之前已经被提出。
已有一些生物化学和神经病理学的研究表明，谷氨酸系统的激活可能在自闭症大脑成熟变化中发挥作用。在多项研究中通过与健康人的对照，发现自闭症或阿斯伯格综合征患者血浆中谷氨酸水平有所升高。谷氨酸脱羧酶蛋白是负责大脑中谷氨酸正常转化为GABA的酶，通过对自闭症患者脑部的尸检研究，发现到该酶含量有所减少，这表明自闭症患者脑中谷氨酸或转运蛋白受体密度有所增加13]。迄今，遗传基因研究显示6q21 中的谷氨酸受体基因GRIK2 的突变表现在8%的自闭症患者和4%的对照个体中，并且可能是由母亲遗传给男性患者¹4]。此外，有证据表明，在第7条染色体上第8类代谢型谷氨酸受体基因的连锁不平衡变体存在易感性突变15]。已有报道称， NMDA受体GRIN2A 亚基的单核苷酸多态性与自闭症有关16]。
脆性X 综合征病人里很多具有自闭症症状，这与代谢型谷氨酸受体信号传导异常有关。最近对此综合征的基因/蛋白质组学的研究强调了代谢型谷氨酸受体系统在自闭症类似症状的病理生理机制中的重要性。
在自闭症研究中应用的谷氨酸能/γ-氨基丁酸能调节剂很少：只有利鲁唑、美金刚、金刚烷胺、D-环孢菌素、右美沙芬，以及Arbaclofen 的新数据(校译者注：Arbaclofen是一个比较老的GABAb受体的激动剂baclofen 的前体。现在也被在自闭症上进行临床试验。这里指的是从临床试验里得到的新数据)。包括对第5类代谢型谷氨酸受体(mGLUR-5) 抑制剂在内的其他一些药物的研究仍在进行中。
利鲁唑
利鲁唑是一种能增强神经保护和神经可塑性的谷氨酸能调节剂18,其在治疗肌萎缩性侧索硬化中具有重要作用。新近研究证实，利鲁唑可用于治疗 OCD(强迫症)、双相情感障碍和广泛性焦虑症。 Wink 等在2011年报道了3

348    ASD 的个性化治疗和一生不同阶段的议题

名 ASD 患者的利鲁唑使用案例。该研究显示患者在重复行为、自我伤害和侵略性方面有所改善19]。据Veenstra-Vander Weele的病例报告，一个13岁女孩通过50mg BID的利鲁唑治疗后，其强迫性和侵略性症状有所改善。近期的一项小规模随机对照试验表明，利鲁唑辅助利培酮的治疗方案对自闭症儿童的易激症状是有效的21]。其涉及的作用机制包括抑制谷氨酸释放、增强谷氨酸转运蛋白对谷氨酸的摄取、增加AMPA受体(一种离子型谷氨酸受体)在细胞内的运输、刺激脑源性神经生长因子(BDNF) 的合成，以及抑制蛋白激酶 C 从而使得氧化应激的减少。继续使用更好的研究设计来评价药物对自闭症核心和相关症状领域可能的功效和安全性是十分重要的。
美金刚

该药物阻断NMDA受体的病理性激活并抑制突触噪声，但允许相关的生理性突触信号被探测到。这不只有神经保护作用而且能从由于突触可塑性丧失造成的病症中恢复23]。该药物在临床中对减缓阿尔茨海默病患者记忆的退化有良好的效果24,25]。几项开放性研究报道了美金刚对 ASD的作用。 Owley等。另外还有几项随机的临床试验目前已在clinical tri-als.gov 网站注册准备开始实施。
金刚烷胺

金刚烷胺在常规剂量下具有NMDA非竞争性抑制剂活性。在自闭症儿童中进行了一项金刚烷胺的双盲对照试验。尽管病人对该药物耐受性良好，但其对易激性和多动症状只有轻微的效果3¹]。然而，金刚烷胺对NMDA受体的亲和力很低，因此可能需要使用比美金刚高10～20倍的使用剂量[³2]。
D-环丝氨酸
D-环丝氨酸是NMDA 受体部分激动剂。在对自闭症儿童的一项单盲试验

第19章自闭症谱系障碍的精神药理学的未来导向 349

中，该药物对异常行为量表(AberrantBehaviorChecklist)中的CGI 和社交退缩子量表有显著改善作用，并且病童能承受此药多数使用过的剂量33】。
右美沙芬
右美沙芬是NMDA 受体拮抗剂。已有报道称在关于自闭症儿童的一系列案例研究和单一被试实验设计的研究中，该药物可改善问题行为，如发脾气和自伤行为(SIB)以及焦虑、运动规划、社会化和语言。
GABA-B受体激动剂

改善大脑的兴奋-抑制比率的另一种方法是增强GABA 系统的抑制作用。早期开放数据的一项选择性 GABA-B受体激动剂(Arbaclofen)有益于脆性X 染色体综合征的初步实验证据表明，其能改善社会反应能力、易激性和全身功能36],而对脆性X 染色体综合征患者的一项小规模随机对照试验显示该化合物在改善社会交往方面具有良好的前景37]。
总之，对于谷氨酸/GABA 系统的调节可能为ASD相关症状的治疗提供了新的分子药靶，且该领域的进一步研究工作亟待进行。
免疫调节剂
现已证实免疫、炎症反应以及氧化应激的异常至少对部分自闭症患者具有影响。
尽管与特定疾病的联系在各研究中尚不一致，但通过一系列研究已经证实了自闭症与自身免疫性疾病家族史之间的关联。事实上，该数据与怀孕期间总体的自身免疫状态与ASD的风险增加最为相关。其中一个假设是母体中存在的抗胎儿大脑抗体可能会在发育期间与神经元靶标结合。虽然尚不明确其机制，但已有动物模型能够支持这一假设[39】。
对 ASD 儿童的免疫差异也有较详实的记载。一项对自闭症患者脑组织进行尸检的研究显示，在大脑皮层、白质和小脑中存在激活和持续的神经炎性反应过程。特别是注意到了小胶质细胞和星形神经胶质的激活。神经胶质细胞的活化可产生显著的神经元和突触变化，可能会引起中枢神经系统 (CNS) 功能障碍。有报道称脑脊液(CSF) 促炎性细胞因子，包括IL-6、干扰素 (IFN)-y 和 MCP-1的增加。所有这些变化进而表明在一些 ASD患者中存在免疫应答失调和促炎细胞因子水平的升高。有证据表明，细胞因子水平的改变与动物和人类的行为变化有一定关联。例如，对小鼠直接施用IL-1、 IL-2和 IL-6 将导致其很大的行为改变，包括挖掘、搜索、嘶叫、梳毛46,以及其

350 ASD 的个性化治疗和一生不同阶段的议题

他刻板运动行为的增加。
一些与ASD 相关的神经递质也具有免疫调节的特性。例如，谷氨酸受体被认为参与了T 细胞调节，且在没激活和激活的T 细胞中存在表达差异。这两种受体都可以作为抗体的靶标。这个机制尽管在ASD 中尚未得到证实，但已在一些癫痫发作和运动障碍里得到确认3],因此，神经递质的调节异常可能是所观察到的某些ASD免疫差异的原因。
对于免疫系统是否可以作为治疗靶点这个问题尚存在争议。到目前为止，只有类固醇、静脉内(IV) 免疫球蛋白和抗生素的小规模研究有文献记载，且从小样本研究中呈现出了矛盾的结果50-53。其他潜在的化合物可能是调节细胞因子(例如米诺环素，Omega-3 脂肪酸) 或 L-肌肽)[56,571,或一些影响小胶质细胞活化的物质 (例如吡格列酮，Omega-3 脂肪酸)。上述所有的实验数据都差强人意，仅有NAC已在随机对照试验中显示其可以改善易激性。然而，NAC也是NMDA 抑制剂，并且尚不清楚抗氧化机制对其作用的贡献。
我们将重点关注Omega-3脂肪酸和吡格列酮这两种药物，它们可作为免疫调节方法对ASD发挥治疗作用的实例。
Omega-3 脂肪酸

Omega-3 脂肪酸是一类特殊的多不饱和脂肪酸，包括α-亚麻酸(alpha-lin- oleic acid,ALA)、二十二碳六烯酸(alpha-linoleic acid,DHA)和二十碳五烯酸 (eicosapentaenoicacid,EPA) 。DHA 和 EPA 衍生自鱼油。越来越多的实验数据表明这两种脂肪酸是大脑重要的结构和功能组成元件，并且认为其对多种神经发育障碍(包括情绪障碍、精神分裂症、多动症和自闭症)具有治疗作用。在胎儿期的最后3个月和儿童期的前2年，大脑经历着一个快速的生长过程。 DHA是大脑在生长发育期间感觉、感知、认知和运动神经系统发育所需要的一种营养物质。尽管DHA对神经元膜结构最为重要，但EPA 也对大脑功能起着重要作用，并且其衍生物还是免疫、内分泌和心血管功能的关键调节剂60]。尽管相关研究数据是混合的，但已证实了补充Omega-3 脂肪酸在许多神经发育障碍的治疗中可以发挥一定作用。许多患有多动症和诵读困难的儿童口服补充该营养物质有效。据研究报告称，Omega-3 脂肪酸还可以减少大学生的攻击性和冲动行为。Omega-3脂肪酸被证明具有抗炎作用，可能包括降低促炎物质⁵4]和减少小胶质细胞活化，从而可以作为有效的免疫调节剂。

第19章自闭症谱系障碍的精神药理学的未来导向 351
已有少量研究表明Omega-3 对自闭症儿童有潜在疗效。Amminger等70报道称，其在改善多动症状和机械重复的效应值高于d=0.7 。2011 年， Bent等7公布了一项探索性随机对照试验的结果，这项试验用于确定Omega-3脂肪酸治疗27名ASD患儿(3～8岁)多动症状的可行性、初始安全性和有效性。12周后，通过异常行为量表(Aberrant Behavior Checklist)的测评，多动症状在 Omega-3 脂肪酸组中提高了2.7(±4.8)分，而在安慰剂组中为0.3 (±7.2)分(P=0.40; 效应值=0.38)。发现在五种脂肪酸水平的降低和多动症状的减轻之间具有相关性，且治疗耐受良好。然而，目前尚没有对自闭症核心症状有效的记录，这仍是一个非常活跃的研究领域。
吡格列酮
吡格列酮是一种过氧化物酶体增殖物激活受体(PPAR)-γ 的激动剂，是调节胰岛素敏感性的细胞核激素受体。 PPAR-y的激动剂包括 Omega-3 和Omega-6 脂肪酸、非甾体抗炎药(NSAID), 几种前列腺素和噻唑烷二酮 (TZD),其中括吡格列酮和罗格列酮。这类药物因其具有胰岛素调节作用，最初被设计用于治疗Ⅱ型糖尿病。然而，一系列基础科学研究已显示其具有抗炎作用，因此它们被考虑用于治疗炎性病症，例如动脉粥样硬化、牛皮癣和炎性肠病。大多数研究都集中在对单核细胞/巨噬细胞和内皮细胞的影响，因为PPAR-γ 可以调节这些细胞产生的炎症细胞因子并控制免疫细胞的分化和功能。据近期发表的一项吡格列酮应用于多发性硬化的试验报道称，随机分组的吡格列酮服用者与安慰剂服用者相比，其灰质萎缩显著性减少77。此外，毗格列酮还具有一些非依赖PPAR-y 的效应,例如对NMDA型谷氨酸受体的抑制。由于最近提出的自闭症超塑性的模型，这种抑制作用是特别令人感兴趣的。
体外及早期体内研究已证实，吡格列酮对自闭症的病理生理学具有多种令人感兴趣的效果。其中包括抑制炎症细胞因子(IL-1b 、IL-6 和 IL-8)的表达。
已有文献报道了应用吡格列酮治疗儿童自闭症有效的一些资料。病人各方面的症状服药后都有所改善，而且药的安全性几乎没有问题[83;但是该研究中使用的剂量超过了成人的最大推荐剂量，因此有必要继续深入对该化合物的研究。此外，需要关注到其对膀胱毒性和心力衰竭的影响。
总之，尽管ASD中免疫差异的病理生理学尚未明确，且免疫调节剂的早期研究充其量也只得到了好坏参半的结果，但免疫调节机制仍是一个具有吸引

352                ASD 的个性化治疗和一生不同阶段的议题力的治疗靶标。
针对神经电路的药物可能改善核心症状的严重程度

系统神经科学已经提出了几种可用于调节自闭症严重程度的几个神经通路和分子靶点，尽管它们不一定涉及自闭症的病理生理学。例如MET 多态性、CNTNAP多态性[85和催产素及加压素作用系统。我们将简要回顾支持选择催产素和催产素受体作为ASD分子靶标的依据。
催产素(Oxytocin,OXT) 是下丘脑室旁核和视上核合成的肽类物质。现已发现催产素及与其密切相关的肽和精氨酸加压素(AVP)的中心释放会影响社会认知和功能，包括社会认知、社会记忆、分离痛苦和社会依附等其他方面。
这两种激素已在动物模型和正常人中进行了广泛研究，证实了其对社交互动和重复行为会产生重大影响。在动物模型中，已证实催产素会影响社交信息处理、辨识、情感链接和刻板行为例如过度的梳理5,86,871;此外，催产素基因敲除小鼠具有社会认知缺陷。许多研究者都发现了ASD 中的催产素水平异常。Modahl 等的报告称，与同龄的正常儿童相比，自闭症儿童的血浆平均催产素水平较低[⁹2]。另有研究证实，催产素受体基因和自闭症之间的遗传相关联，尽管这种关联是很弱的。
在过去的10～15年间，基于基础科学和前期临床研究的依据进行了早期临床试验。2003年，Hollander 等99报道了给予静脉注射(IV)催产素可显著性减少重复行为。该实验组在2007年的研究发现,静脉注射(IV)催产素有助于ASD 成年患者认知功能的保留。 Anagnostou 等在2012年报告了一项为期6周的可行性试验结果，该试验意在探索使用静脉注射催产素对社会认知/功能和重复行为相关的安全性和有效性问题。通过对主要结果进行分析后发现，与安慰剂相比，静脉注射催产素治疗可以改善社会认知/功能和重复行为以及整体功能。目前正在进行几项大规模的临床试验，以探索鼻腔给药催产素干预对ASD儿童、青少年和成年患者的疗效。目前对于使用催产素

第19章自闭症谱系障碍的精神药理学的未来导向 353

是否为操控催产素系统的最佳方式这一问题仍存在质疑，几家公司正在研发催产素类似物或能导致CNS 中催产素分泌的增加的化合物。
未来方向：针对 ASD 生物学的药物治疗与行为学干预相结合

最后，影响突触可塑性或社会学习或神经炎症的新型药物必须与有效的心理学干预方法结合使用，以强化其干预效果。 ASD 最终将表现为一种技能获得的障碍，因此多模式干预以最大化其治疗效果是十分必要的。相关研究不仅繁冗且花销巨大，需要科研基金发放机构和研究单位给予极大的支持。然而，这种方法的可行性已逐渐得到证实。

结论

来自基因组学、蛋白质组学/代谢组学、神经病理学和系统神经科学的新兴依据为我们提供了一系列新的分子靶点，这将有希望能够开发针对 ASD的特定“病变”的药物，以期治疗自闭症的核心症状。随着基础科学转化能力的提高，以及基于这种转化的新兴化合物的出现，有望将新药与针对学习能力的行为方法相结合来提高 ASD 患者的长期疗效。

本章要点

● 目前大多数可用于治疗ASD 相关症状的药物尚没有通过转化途径而成为治本的药物。因此，它们对ASD 核心症状的作用微乎其微。
●来自基因组学、蛋白质组学、神经病理学和系统神经科学的新兴依据揭示了一系列可作为新药开发候选的分子靶点。
●将这种治疗与行为/心理社会学习干预方法相结合，可能会对ASD 患者的长期疗效产生显著性影响。

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第20章

自闭症的共病——潜在的生物学机制和/或亚型诊断的线索

Margaret L.Bauman
孙睿睿孔健译，孔学君校

摘要
自闭症，自1943年被首次提出以来，一直以社交障碍、言语迟缓甚至不能进行正常沟通、动作重复、行为刻板等为该病的主要特征和基本临床表现。据估计，近约50%的自闭症患者无法正常言语，多数与感觉信号处理功能障碍有关。而大多自闭症患者表现出破坏性行为，迄今已将其归因于“自闭症的部分表现”。不仅如此，许多自闭症谱系的儿童患者很难通过常规的门诊检查诊断出来。因此，该病的评估以及相关医疗情况的潜在意义往往被忽略。随着临床水平的提高，发现存在很多共病情况，这些共病一经诊断治疗，有助于改善自闭症的行为异常、预后，并提高其生活质量。并且，随着对自闭症共病的密切关注，医疗上不仅实现对自闭症潜在的诊断学生物标记物进行发掘，更加强其治疗方案，而且开始对该病特异性的临床和生物学亚型进行甄别。
关键词：行为；医疗评估；治疗；临床亚型；预后；生活质量。

前言

自闭症是一种以行为定义的病症，于1943年被LeoKanner首次提出!。 Kanner 在原文中指出，他的一些病人表现出“自闭性孤独”“强迫性地坚持刻板的千篇一律”等特点。多年来，对该病临床特点的定义已从侧重心理动力学解释为自闭症源于“天生”这一观念有了转变。直到1960年，随着美国《精神障碍诊断与统计手册》第3版(The Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorder,DSM-Ⅲ) 的发布，在出生后30个月内出现语言和社交障碍、对外界环

第20章自闭症的共病——潜在的生物学机制和/或亚型诊断的线索 363

境的怪异反应，被增列为自闭症的主要特点。随着1994年 DSM 第 4 版发布2],自闭症的定义更为适用于自闭症是一个涵盖不同程度的病情、认知能力和行为表现等的症候群这样一种认识，从而拓宽了该病的定义。为寻求更为严格的诊断标准，2013年最新发布的DSM第5版³,将自闭症定义为：①社交沟通和社会互动上的持续性缺损；②局限、重复的行为。然而，诊断上仍要求注明是否伴随相关认知障碍、疾病或遗传因素、和/或语言缺损。
尽管DSM第5版试图将自闭症定义得更为严谨，但在研究人员和临床医生看来，自闭症病因复杂、神经生物学和临床表现多样化，其定义一直饱受争议，最终以“自闭症谱系”(Autism Spectrum Disorder,ASD)作为该病的医学名词，较为广泛接受。临床上，自闭症表现多样，包括不同程度的认知障碍。近期数据表明，将近一半的自闭症患者有显著的智力缺损⁴。在童年早期测量自闭症儿童的头围发现，约20%的自闭症儿童头围处在其同龄、同性别儿童的 98%上限位5。
直到最近，自闭症相关的临床、基础科学研究着力于从大脑神经生物学角度切入研究，研究结果取得了显著的进展。然而，过去几年中，研究结果显示除了大脑以外，其余器官系统可能在自闭症中发挥了重要作用，其中，多个系统受累可能直接导致了该病的一些临床表现。而且，这些系统出现功能障碍，可能与自闭症形成的生物学机制密切相关。因此，对自闭症的共病更直接地进行评估，有利于辨别自闭症患者个体的表型和遗传簇特点，从而为甄别自闭症亚型作潜在铺垫，并通过这些亚型，更清楚地了解该病的特异性病因和生物学机制，最终指导临床干预和治疗。
本章重点阐述自闭症并发的几个神经疾病和内科疾患，这些疾病因其对自闭症的临床特点产生重要影响而受到越来越多的关注，只有了解它们本身的神经生物学机制，才能够更透彻地了解它们如何对自闭症产生影响。

癫痫发作

多年来，研究发现不少自闭症患者在他们人生的某一阶段发展为癫痫。自闭症和癫痫的关系成为最近一个论坛的热点，该论坛由国家神经性疾病和卒中研究所(the National Institute of Neurological Disorders and Stroke,NINDS) 主办，一些其他相关部门和组织承办，该论坛的会议流程和进展将发表于2013年10月的Neurology 杂志上。此次研讨会对自闭症、癫痫、智力障碍(intel- lectual disability,ID)三者之间的关系较为关注。自闭症兼见智力障碍的患者中，癫痫发病的风险率高达21%,而自闭症中无智力障碍的患者，癫痫发病的风险率为8%。并且，有研究表明，自闭症患者12岁后出现癫痫发作，且持续

364    ASD 的个性化治疗和一生不同阶段的议题

到成年，其癫痫发病的风险远高于其他人。
有研究认为，癫痫发作出现的峰值在童年早期和青春期7。尽管自闭症患者出现复杂部分性癫痫发作的报道最为常见，其余各型均可出现于自闭症患者中，包括：运动性大发作、肌阵挛、热痉挛。有数据显示，自闭症患者12岁后出现癫痫发作，20岁前癫痫发病率为30%。尽管癫痫发作好发于自闭症患者，可能与其智力障碍有关，如上所述，其他因素诸如畸形、运动损伤，再如一系列症候群包括结节性硬化症、X 染色体易损综合征、雷特征等，均被认为是重要影响因素。
研究还表明，自闭症并发癫痫发作，可以反映二者共有的潜在神经生物学机制，有假说提出，二者病理生理学机制相同，可以诱导脑神经突触可塑性异常，发育中大脑兴奋/抑制的失衡状态6,这些异常已经被发现在症候群性自闭症中，它们存在罕见的拷贝数变体及罕见的基因突变。然而，将这些变异或突变作为自闭症患病风险因素的报道中，鲜有兼见于癫痫和自闭症二者的情况，也不全与智力障碍相符⁹]。未来基因遗传研究中，需将这些因素纳入考虑。
环境因素可能也对自闭症、智力障碍、癫痫的发病起到一定作用。已报道的风险因素包括：早产、低体重儿、孕期母体服用某些药物、高龄生产。免疫因素也常被认为是潜在风险因素。
有报道指出，自闭症、癫痫和智力障碍拥有共同的神经病理学和神经生理学特点，包括：大脑皮质发育不良、神经细胞坏死、异位、发育异常，提示神经元迁移和神经发生异常6,10]。Kang 与 Barnes(2013) 提出假说，认为GABA 能信号能缺陷可以解释为什么自闭症和癫痫发作并见。神经生物学研究分别在自闭症和癫痫的尸脑中发现GABAα受体亚组和GABA 能回路的改变11-13]。并且，至少有一部分病患的影像和神经病理学研究均表明，自闭症和癫痫二者存在共同的脑发育改变10]。有待更多研究去挖掘上述或其他可能存在的神经生物学机制，以便能够具体表述自闭症伴发或不伴发癫痫发作的特点。

胃肠紊乱

目前，自闭症患者中胃肠(gastrointestinal,GI) 紊乱的确切患病率尚不知，据一项研究估计，在9%~70%范围内波动，或更高，数据随患病群体和纳入的临床表现要求而发生变化¹4]。虽然多数自闭症患者，如果表现出呕吐、腹泻、胃脘痛或便秘、其他等症状，较易识别，但多数尤其是言语沟通障碍患者，可能不能给予明确的线索。目前，尚无可靠线索或症状能够持续辅助医师进行初步诊断，以辨别破坏性的行为是疼痛不适引起的，还是源于心理遗传或情绪

第20章自闭症的共病——潜在的生物学机制和/或亚型诊断的线索 365

因素。
借助于循证指南对自闭症患者进行胃肠疾病评估尚不适用。然而，2010 年随着大量文献回顾，并结合临床、科研经验，一个有经验的胃肠病学专家小组联合发文，列举了对自闭症儿童胃肠紊乱进行诊断和治疗的最佳措施[15。该文着眼于慢性便秘、腹泻、呕吐、胃炎、食道炎、胃食道反流(gastroesophageal reflux disease,GERD)、肠炎、乳糜泻、炎性肠病、克罗恩氏病等研究。并且，该组专家强调，在某些病例中一些破坏性行为，后来被发现与胃肠紊乱和不适有关，其有可能成为临床诊断胃肠功能失调潜在的“危险信号”(“red flags”)。这些行为包括：做鬼脸、颈部伸展、不停的吃喝、咀嚼如衬衣袖子等非食用物品、囫囵吞咽、扣击胸部、按压腹部、无故攻击他人、自残和睡眠障碍等16。
众所周知，即使在正常发育的儿童，当感觉不适时也常常会出现破坏性行为。这在自闭症谱系儿童当然也是如此，同样的，当一个个体感到不适时，其参与日常活动、适应周围环境或社交场合的能力会大打折扣。通过鉴别诊断、治疗诸如胃肠紊乱等伴发病症，有利于促进患者更好地学习、社交及成长。
自闭症研究越来越受到广泛关注，包括探索有关肠吸收不良、渗透性异常，胃肠动力失常，乳糖不耐症，食物过敏，大脑和肠道共同的重要神经传递系统，不同的饮食干预作用。并且，肠道菌群含量以及其如何作用于机体功能以维持生命健康成为新兴的研究热点。上述研究及其他肠道影响因素研究的广泛开展，有利于充分提升并拓展我们对自闭症潜在的生物学机制的理解。
然而，与神经系统疾病相比，胃肠紊乱在自闭症患者中是否较为常见，尚且不知。同样，对于自闭症患者出现的胃肠紊乱，是否采用与典型胃肠病人相同的治疗干预，并不知晓。又或者，胃肠功能失调是否是自闭症亚型患者所特有，还是仅为伴随现象，也不得而知。一些证据提示，某些病例中，自闭症合并胃肠功能紊乱患者可能是自闭症谱系中的一个亚型或者一个亚型的一部分。 2009年，Campbell等报道，MET 基因信号可增加自闭症患者患有家族遗传性胃肠功能障碍的风险。MET 是一种多效基因，不仅有助于胃肠修复、促进胃肠动力，而且在大脑发育中起到重要作用。该研究说明，借助于自闭症共病研究，如胃肠紊乱作为自闭症患者表型特点的一部分，我们能够在这个复杂多样的疾病谱系中开展对自闭症亚型进行有效定义。

睡眠障碍

睡眠模式受扰在自闭症患者中十分常见，其发病率大约为40%~ 80%。较为常见的是由父母反映自闭症儿童的睡眠模式，包括：睡眠延迟，睡眠维持障碍、睡眠时间减少。此外，自闭症其他类型的睡眠障碍

也有报道：包括睡眠的昼夜节律障碍、与呼吸有关的不典型睡眠障碍、梦魇、夜惊、睡眠相关运动障碍。虽然上述这些睡眠障碍模式，尤其是夜间觉醒，可见于正常发育的儿童中，但在自闭症儿童中出现更持久、更常见。
自闭症患者好发睡眠障碍的起因尚不清楚。相关假说包括：①家庭、环境等因素不利于培养良好的睡眠；②与自闭症核心症状有关的心理或行为障碍； ③引起脑结构或化学改变的生物或遗传异常。以上任何一种单一因素，或合并因素均可导致睡眠障碍20
对于潜在的心理因素，如焦虑、抑郁、情绪失常、应激和注意力缺陷多动障碍等，或并发症，均可对自闭症患者的睡眠障碍产生重要影响。另外，某些特殊疾病，除了胃肠功能紊乱如胃食管反流症，还有阻塞性睡眠呼吸暂停症、呼吸引起的睡眠障碍、扁桃体肿大引起的呼吸不畅等，均可影响自闭症患者的睡眠。此外，我们还意识到，对于并发其他病症的自闭症患者，联合用药会取得一定效果，如5羟色胺再摄取抑制剂、大脑兴奋剂、某些镇静剂、糖皮质激素、哮喘治疗等。
在潜在的生物学因素中，褪黑素(melatonin) 对于该病的影响研究备受关注。褪黑素是由松果体内5-羟色胺(5-HT) 产生的一种在夜间分泌的神经激素。它对于机体昼夜节律的交替，包括睡眠-觉醒节律，体温调节，都发挥了重要作用。有假说认为，自闭症患者睡眠障碍可能与昼夜节律失调有关，而昼夜节律失调可引起神经系统发生变化，从而错误传递确定周期的信息。因此，基于已知的褪黑素的功能，我们窥探到，自闭症患者睡眠障碍可能与褪黑素合成及其在突触变化中的调解作用有关的遗传基因异常相关。
睡眠障碍对儿童及其家庭的日常活动、发育程度、生活质量均可造成广泛影响，因此有效的干预治疗非常重要。治疗措施一般包括：提供可预估的睡眠环境、纠正不当的行为活动，往往通过行为疗法来实现。也可考虑采用药物疗法。越来越多的证据支持褪黑素疗法，因为褪黑素被认为是一种营养供给，不需要处方用药便能自己获得。有效数据显示，褪黑素有助于入睡，服用后几乎无长期的不良反应。然而，迄今为止，褪黑素的用量、安全性、有效性研究尚不深入，有待进一步研究。与此相仿，支持使用其他药物促进和维持自闭症患者睡眠的数据较为有限。药物如可乐定，曲唑酮、氟伏沙明、米氮平和氯米帕明，都对于某些病例有显著疗效，某些抗癫痫药也是如此。就治疗自闭症睡眠障碍的有效性而言，上述任一药物均未经过严格验证，仍有待进一步研究确认。这些研究可以前瞻性地探索这类睡眠障碍潜在的生物学机制，有助于进一步描述自闭症系谱的亚群。

第20章自闭症的共病——潜在的生物学机制和/或亚型诊断的线索 367

代谢障碍

一般来说，在神经发育障碍的父母中，可识别的代谢异常相对少见，据估计发病率为1%～2.5%。目前，自闭症患者中代谢异常的发病率尚且不知。
线粒体功能障碍

在过去十年中，越来越多证据表明，线粒体功能失调对非症候群性自闭症造成潜在影响，已引起广泛关注。现阶段，对自闭症患者线粒体功能障碍发病率的预估差异较大。2005年，Oliveira 等人发表了一项对患有自闭症的学龄儿童进行大样本调查的研究，结果指出，当中7.2%受试者符合线粒体呼吸链障碍的诊断标准22]。然而，更新研究指出，80%的自闭症儿童均有线粒体功能障碍的表现。
线粒体是特殊的细胞器，在细胞中发挥与疾病的病理生理学相关的四种核心功能，这些功能包括：①通过氧化葡萄糖和脂肪酸形成三磷酸腺苷(adeno- sine triphosphate,ATP),给细胞供给绝大部分的能量；②产生、调节活性氧族； ③缓冲细胞内钙离子；④通过线粒体渗透性转换孔调节细胞凋亡24]。线粒体向细胞供给大量能量，因此线粒体功能障碍对高能源需求的器官组织影响更为重大，这些器官组织包括：大脑、肌肉、心脏、胃肠道和内分泌系统。当然，任何器官系统均可累及。
线粒体功能障碍表现多样，大多脏器系统均可累及。线粒体功能失调可由编码线粒体蛋白或结构 RNA的线粒体DNA(mitochondrial DNA,mtDNA)或核 DNA(nuclearDNA,nDNA)基因缺陷导致。线粒体障碍被认为相对少见，就 mtDNA功能障碍而言，其发病率据估计为1/5000,且在1/200胎生的脐带血中探测到病原性的mtDNA 突变。nDNA 突变影响线粒体基因的情况较mtDNA 突变更为常见24]。
临床上很难分辨自闭症患者是否伴有线粒体功能障碍，也没有相应的较为持久可靠的筛查检测方法。2006年Morava 等人列出该病的诊断标准，被广泛应用于临床和科研25]。这些标准考虑了临床、影像、代谢、形态学等因素的权重，且综合评价了线粒体功能障碍出现的可能性。由于大多家庭无法接受肌肉活检这一有创性手段，因而，通过肌肉活检确诊线粒体功能障碍成为一个令人恐慌的因素。如不采用活检，则不利于线粒体功能障碍的确诊。2008年， Weissman 等报道了一组25例自闭症患者，每例均经活检确诊为线粒体功能障碍26。该作者回顾了患者的过去史、临床特点、实验室检查结果和发病历程，

368    ASD 的个性化治疗和一生不同阶段的议题

得出结论，通过一些症状和实验室的“危险”(“red flags”)信号能够辨别自闭症儿童是否患有线粒体功能障碍，包括体力不佳、行动迟缓、3岁后出现功能退化，累及多器官系统。其他特点包括：血中乳酸、丙酮酸和血浆丙氨酸异常。该作者得出结论，合并线粒体功能障碍的自闭症儿童可结合其详细的临床和生化评估，从普通自闭症儿童中区别开来。不仅如此，该作者提出自闭症合并线粒体功能障碍可能体现了自闭症谱系中的一个亚群。
在此期间，线粒体功能障碍对自闭症中的影响越来越受到广泛关注。该功能障碍是否原发(成因)还是继发(伴随症状),目前尚无定论。因此，自闭症患者线粒体功能异常将是未来研究的重点。
其他潜在的重要代谢性疾病
考虑到线粒体功能障碍越来越受到广泛关注，临床医生和自闭症领域的科研工作者正开展与自闭症症状有关的其他潜在的代谢性疾病研究。这些疾病种类繁多，在此不一一详细列举，但在此文中将提及以下几种疾病，如能在某些病例中辨识这些疾病，对于提高临床疗效具有重大意义。
Smith-Lemli-Opitz 症候群(Smith-Lemli-Opitz    syndrome,SLOS)

Smith-Lemli-Opitz 症候群常与自闭症症状相关。SLOS 是一种11q12-13 常染色体上7-脱氢胆固醇还原酶(DHCR7)突变导致的先天性胆固醇合成缺陷相关的常染色体隐性疾病。胆固醇不仅对胚胎和胎儿的生长，还对神经刺激性类固醇的合成和髓鞘膜的生长均具有重要作用。并且，胆固醇还被认为能够调节催产素受体、G蛋白藕联血清素-1A 受体和配体的功能活动。有研究认为，胆固醇不足可能影响这些生物学机制，而后导致自闭症患者伴有该病的临床表现。据估计，5%～75%的SLOS 患者符合自闭症的诊断标准28]。 SLOS 可由胆固醇水平相关的血浆7-脱氢胆固醇水平升高确诊。辨别该病非常重要，因为该病是自闭症的病因之一，且部分能够通过补充胆固醇予以治疗。
脑叶酸缺乏症(Cerebral folate deficiency syndrome,CFD)

脑叶酸缺乏症被认为是由于叶酸进入血脑屏障受阻引起的一种疾病。6 项研究报道，自闭症伴有脑叶酸缺乏症的亚群中，大多数患者表现出显著的神经功能异常。然而，近期一项对93例自闭症患儿进行的研究显示其未出现明显的神经功能异常。2013年Frye 和Rossignol 研究发现，75.3%的自闭症患者具有能够阻碍叶酸进入血脑屏障的叶酸受体自体抗体(folate receptor autoanti- bodies,FRAs) 。若给予叶酸受体抗体阳性的自闭症患儿亚叶酸钙治疗，其语言沟通、社交、注意力、刻板的行为均有所改善。考虑到叶酸受体抗体在自

第20章自闭症的共病——潜在的生物学机制和/或亚型诊断的线索 369

闭症患儿中普遍好发，该文的作者建议所有自闭症儿童进行叶酸受体抗体检测。
X 染色体相关的先天性肉毒碱生物合成缺陷
近年来，X 染色体相关的先天性肉毒碱生物合成缺陷被认为是没有畸形的自闭症发病的危险因素。2012年Celestino-Soper 等报道了在原发性自闭症患者中发现了三甲基甘氨酸羟化酶epsilon 基因(trimethyllysine hydroxylase ep- silon gene,TMHLE)外显子缺失30]。TMHLE定位在X 染色体被认为具有编码肉毒碱生物合成第一个酶的功能。研究发现，家族中有两个或以上男性自闭症患者的个体出现TMHLE 不足的现象更为频繁，是对照组或家族中只有一名自闭症患者的个体发生频率的2.82倍。这些发现提示，肉毒碱代谢失常可能是诱发非畸形自闭症的一个重要因素，并且肉毒碱通路因其导致自闭症的一些症状而显得至关重要。该领域研究可有助于发现相应的预防和治疗措施。
不仅是越来越多的综合征，还有一些疾病，也被发现与自闭症相关。例如，很久之前便发现一些苯丙酮尿症病例与自闭特点相关联。其余如肌酐不足³,尿素循环障碍[32,威尔逊氏病(Wilson's Disease)和莱施-奈恩综合征 (Lesch-Nyhan syndrome)³3已成为相关热点话题。一些代谢紊乱疾病越来越受关注，反映出一个事实，即如果被确认与自闭症有关，这些当中的许多疾病则有可能被治愈，且最终能够一定程度上缓解自闭症症状。不仅如此，辨别上述这些疾病可将自闭症谱系疾病进行亚型的初步分类，有助于更好地了解形成自闭症谱系疾病一些核心特点的潜在生物学机制。

讨论

自闭症自1943年首次提出以来，以一系列行为、认知、沟通/言语和社交障碍为其主要特点，多年来，该病被认为是归因于精神因素，但在过去25年里，逐步被确定为是一种脑神经发育障碍疾病。大多数病例证据提示，该病源于胚胎期。现今认为，自闭症具有临床表现多样、病因繁多、生物学特点复杂，因此常用“自闭症谱系疾病”命名该病。
与自闭症谱系疾病相关的大多研究着重于探索大脑及其相关的神经症状。然而，在过去的5～10年里，已发现许多自闭症病例常有脑外脏器系统的累及。而且，越来越多的确切证据表明，常由于任一疾病的疼痛和不适，可导致破坏性、重复性、侵略性行为。这一现象于2007年被 Carr 和 Owen-Deschryver在报道言语发育障碍患者疼痛相关的问题行为中提出34]。据估计，约50%的自闭症谱系患者语言障碍，因而无法表达其病症或不适。并且，

370             ASD 的个性化治疗和一生不同阶段的议题

许多患者感觉信息处理缓慢，他们辨别不适或疼痛的部位的能力受限。因此毫无疑问，行为展现是一些自闭症患者表达他们不适的唯一途径。
如上所述，很多临床疾病在自闭症谱系中共存相当常见。直至最近，这些疾病或许因为某种原因，仍未受到足够重视。首先，一般全科医生常常遇到的是典型发育期儿童，自闭症患者的不典型症状不容易识别；其次，由于自闭症儿童言语/沟通能力有限，兼杂不合作行为，难以对其进行查体。显然，自闭症儿童患有共病后可表现为破坏性行为，直至最近，才将这些行为归类成为“自闭症的一部分”。虽然目前尚无可靠的流行病学数据，但胃肠道功能紊乱似乎相当常见。然而，其他潜在的疼痛相关疾病，如感染、咽喉疼痛、牙齿不适、鼻窦炎、尿道疾病或骨折尚无研究。所以说，在假设这些自闭症儿童的异常行为是需要行为干预和/或心理药物治疗的单纯行为问题(“behavioral”) 之前，应该探索其共病存在。并且，越来越多证据表明，治疗潜在疾病有助于提高健康水平，使其更积极得参与教育干预和治疗，有助于提高病患及家庭的生活质量。
另外重要的一点，是将可辨别的共病纳入未来自闭症影像、基因、临床、生物标志物等方面的研究。现今认为，其他脑外脏器系统和大脑有共同的神经介质。众所周知，如5羟色胺是一种与自闭症相关的神经递质，产生于肠道。相关疾病的正确辨识有利于从自闭症谱系中将重要的亚型区别开来，这为我们探索这些亚型提供了一条更直接的生物学途径，有望更为确切得了解这些亚型相关的潜在机制和诊断学生物标志物，以及推进更为适合的治疗方法。

未来方向

考虑到自闭症谱系疾病的复杂性，未来研究的关键，包括基因、影像、心理药理学临床试验、免疫学或其他临床研究，应当包含对受试者过去或目前所患共病的评估和描述。实验室研究探索潜在生物标志物时，应当基于一些特定的共病存在与否，寻求一些与特定临床症候群相关的实验室检查。这些研究可能涉及同一群体的纵向研究，因为其行为、发育和共病类型可能随着时间发生改变。发育轨迹是很重要的线索，如有可能，应当作详细记录。最后，破坏性行为或难以解释的行为变化应当被积极探究，以排除其他潜在的共病可能。

本章要点

● 自闭症谱系疾病是一种临床表现多样、病因各异的复杂病症；
● 自闭症谱系疾患的共病有待进一步研究；

第20章自闭症的共病——潜在的生物学机制和/或亚型诊断的线索 371

● 自闭症谱系疾患的共病的评估和发现有助于发掘潜在治疗手段，进一步改善预后，缓解行为症状；
●共病的评估可能有利于自闭症谱系临床和生物亚型的界定；
● 自闭症谱系疾病合并症的评估可辅助确认该病潜在的诊断标志物，可能更利于治疗措施的制定。

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第21章

全身方法对自闭症脑部健康转化的影响：新陈代谢和电生理之间
转导的神经可塑性机制

MarthaR.Herbert
曹瑾孔健译，董存建孔学君校

摘要
自闭症被认为是神秘且可能由遗传起源的具有高度遗传性的神经生物学病症，是涉及神经认知、感知和情感方面的终身缺陷。这一概念的构建引导人们开始关注寻找潜在的遗传因素造成的自闭症大脑的差异，其被认为是先天存在于该系统中，尤其是在解剖结构上。
最近，人们越来越清楚地认识到单独的基因因素不会造成自闭症。更具包容性的新观点是通过基因和环境的相互作用来影响表观遗传学、细胞信号和生理学。这种表述超越了先验概念或产前基因-环境相互作用会明确地导致一个人自闭症的产生，而是强调所有这些水平的相互作用随着时间的延续而发展变化，这取决于环境、经历和生活方式的选择，并由功能异化的细胞主动产生，而不是简单地由最开始就与正常孩子不同的静态大脑通路引起的。
从这个观点来看，重要的是我们如何用重新看待大脑，以及大脑的“所作所为”是如何造成自闭症行为的。对于大脑中信号生成过程的多尺度、全身性、动态的方法，以及这些过程如何通过多个调节器的动态进行相互作用而形成，其提供了先前对于脑功能改善方面未被重视的可能性。
关键词：自闭症谱系障碍；脑；振荡；多尺度生物学；系统生物学；动力系统；磁共振波谱学；扩散张量成像；脑电图；神经调节；新陈代谢；线粒体功能障碍；连接性；一致性；神经可塑性。

第21章全身方法对自闭症脑部健康转化的影响：新陈代谢和电生理之间转导的神经可塑性机制    375

前言

自闭症，我们称之为自闭症谱系症状(autism spectrum conditions,ASC)而不是自闭症谱系障碍(autism spectrum disorders,ASD),是由于与中性的“症状”一词相比较，“障碍”一词隐喻缺陷，带有某种评判意义，目前在文化和科学层面都有所争议。自闭症已被视为具有高度遗传性的神经生理症状或组合症状，是神秘且推测源于遗传并迁延终身的神经认知、感知和情绪的缺陷。这一概念的构建引导人们开始关注于寻找潜在的遗传因素引起的自闭症大脑的差异，其被认为是先天存在于该系统的，尤其是在解剖结构上。研究人员还致力于寻找更精准的方法来定义自闭症缺陷的性质，为遗传和脑部研究提供严谨的关联。在该方法中突出的是强调基因相关靶点的药物治疗。
然而，在新兴的动态多尺度系统生物学“基因-环境-表观遗传学细胞信号- 生理学”框架中，保持简单的自下而上的确定性方法正在让位于对 ASC 的多尺度、互动性、动态的认识。这反而打开了从多个水平切入并进行干预的途径。
我们需要通过这种系统方法来更新构建大脑在创建和维持自闭症中的作用。因此，接下来我们将：
● 回顾对ASC 的更广泛、更多系统以及更动态的原因的认识；
●着眼于我们已经从这个新的角度观察到的大脑，以及
●提供一个动态的、过程导向的、电生理为中心的生物学模型，形成我们标记为“自闭症”的行为输出。
这里阐述的方法强调了脑功能可塑性可来源于能够调节大脑健康的全身干预措施。总的来说，当我们能够从自闭症是一种先天特征转换成模型，很多时候或有时所有的自闭症可能与动态多变的状态相关，对这个日益庞大、面临巨大挑战并拥有极好天赋的群体，我们会在最大限度挖掘他们的潜能，最大限度减少他们的痛苦方面做出更快、更有效的进展。

并非先天：自闭症不是与生俱来的而是后天造就的

虽然自闭症被认为是遗传导致的神经系统终身疾病，实验依据和临床观察却指向了一种不同的自闭症框架，即自闭症可能并非完全甚或主要由遗传而来的，其可能产生于与环境暴露和压力因素的相互作用，其中一些或许多患者是可以恢复的。以下是重新考虑自闭症发病原因的一些因素：
●报告的病例数量显著增加，对这种增加趋势的分析表明，这不能完全归因

376    ASD 的个性化治疗和一生不同阶段的议题

于认识程度的提高、早期诊断或更宽松的诊断标准1.2]——既然不具有遗传流行病，那至少有一些新病例肯定是来自于“环境”——即这个世界的变化和我们的生活方式。
●我们逐渐发现自闭症不只是基因、大脑和行为的问题，因为在ASC 患者中更常见的问题包括一系列医学问题和全身/系统性的生理异常，这超越了从前认为早期脑部发育障碍是自闭症的原因和核心的理念【3,4]。
●我们在逐步认识到控制行为的不光是大脑还有其他因素。更广泛地看，自闭症领域之外的科学研究揭示了肠道、免疫、内分泌和其他身体系统的改变以及微生物生态学可以改变大脑功能5-12]。
●退化真的会发生(校译者注：在自闭症研究领域里，regression特指原来发育正常的婴幼儿后来丧失了已经学会的社交和语言功能而呈现出社交障碍这个现象)。过去认为一些初为父母的家长称孩子退化为自闭症是由于他们缺乏经验而错过了早期的异常迹象，而目前已有原本基本健康的婴幼儿退化为自闭症的详实记录；这表明自闭症的发病可能取决于接触不良环境因素的长期积累，而并非在胎儿期，或甚至在卵子受精那刻已定[13-171。
●退化的发生可能与健康问题有关，这是因为这两者有着常见的关联。由正常发育退化为自闭症的孩子往往有医学病史，如复发性感染、胃肠道问题、食品过敏、睡眠障碍、皮疹和易激症状18-20]。
● 自闭症不是固定的，而是可转变的。对自闭症患者进行更为严密的观察后发现，患者自身或个体之间在病情的严重程度上在短期和长期里会有很大的变化。有时美好的一天可能由于接触某种食物或化合物就迅速转变成了糟糕的一天。有时病情的改善会短暂出现——如在发烧时。一些自闭症儿童因急性哮喘发作而接受了短期类固醇治疗，其在治疗期间能够更流利地说话且有更多的互动。现已有不少记录表明自闭症患者有时会存在症状的持续改善，甚至恢复到已看不出任何病症的状态。所有这些可变性严重动摇了我们把任何一天的严重程度看成像基因设定的那样一成不变的理念(所有这种可变性对认为我们在任何一天治疗的病情的严重程度是由先天决定的这样的观点提出了挑战。)这将在下面进行更广泛的讨论。
●自闭症不再被简单地认为是一系列“缺陷”,因为许多从前被看作是缺乏或缺失的人体功能现在知道是存在的。认知缺陷现在看来在很大程度上被高估了，部分是因为应用于 ASC 人群的测试与他们的认知方式不相符。ASC人群在某些感知领域比正常人更强大，更有辨别力[26,27。与刻板印象相反，虽然在表达方式上可能存在问题，但可以确定没有情感的缺乏。很少说话(缺少语言)并不等同于缺乏智力，甚或阅读或写作能力的

第21章全身方法对自闭症脑部健康转化的影响：新陈代谢和电生理之间转导的神经可塑性机制    377

不足；越来越多的由于不同原因(如发音困难、肌肉协调及本体感知障碍) 而失语的自闭症患者能够打字，有些甚至能写书。
●自闭症的不同方面是相互关联的。尽管患者各自具有不同的症状组合，但这并不会使每个症状完全离散并独立于其他症状。对此的一个支持是对系统指向的治疗和干预的广泛影响，尽管通常认为其需要被更好地证明。常规医学虽然认为治疗应针对具体症状，但目前各种治疗方法普遍针对抗病能力——无论是改善饮食、减少毒性或是改善神经运动协调——治疗导致某一领域而非特异性靶向的改善。这表明自闭症不只是简单的离散、独立症状的集合，有可能还是完全因为适应功能以及能同时影响许多神经功能范畴的大脑协调总体上出了问题。如果是后一种情况，提高抗病能力 (比如增强大脑的协调能力)能同时对许多神经功能范畴产生积极的影响。这种现象将在下面自闭症是一种“合并特性”而不是离散症状的段落里做进一步详细的探讨。
用一句话总结上述观点的含义，现在看来自闭症不是先天形成而且终身的，而可能是后天造成的，如果能够克服或改变导致它出现的发病原因，那么自闭症也可以得到改善甚至治愈。

这些新的观察告诉我们自闭症如何“发生”?

上述的每个观察结果都表明了功能上的生物学和行为水平之间的相互作用。
●越来越多的案例表明，大脑产生行为的方式会因为环境的影响而发生变化。
●被称为“共病”的自闭症患者体内不同系统的毛病，看似巧合，实际上可能与造成“自闭症”的整体问题有关。
●退化到自闭症表明了整个系统可以转变，因此大脑功能的方式是随时间而改变的。
●退化与患者医学问题的共同关联表明大脑变化的发生与改变大脑基本生物设置的致病原有关。
●自闭症病情的日常变化表明致病的大脑功能并非完全是与生俱来的，而是起起伏伏，这可能是受环境的影响——例如，大脑炎性反应可能会因为化学物质或过敏原接触(甚或睡眠剥夺)而变得更严重，或因无过敏原的饮食、压力减少和具有安全感而减轻。
●症状短期和长期的改善，甚至完全消失而不再符合诊断标准，表明自闭症是一个功能性问题，而不一定是先天就有的特性——功能问题与潜在的表

达障碍相关，而不是潜在的缺陷。症状的改善与除去有害的触发因素(例如过敏原或毒性接触)两者之间的关联，进一步支持了调节大脑“设置”的生理机能可能通过日复一日的生物影响而改变这一观点。
●据观察许多症状是可以彼此协调改善的，表明将症状概念化为由不同遗传影响产生的离散个体，这在生物学上可能是不准确的。
研究和治疗的新方向：对大脑的全身方法

如果自闭症是一种后天发展而来的而并非由基因所定的先天性疾病，那么就会引发一系列全新的问题来推动研究和治疗。这些问题集中在大脑和身体的不同系统相互关联的方式上——它们如何相互维持、帮助或彼此伤害。这是非常重要的，因为我们希望找出具有积极影响的、最为有效和广泛的治疗和干预——我们希望从研究中获得最大的杠杆作用。为了获得这种杠杆，我们需要着眼于阐明关键和内在的转化问题，例如：
● 退化是如何发生的?大脑和身体的变化是什么?是什么触发并驱动了这些变化?
●全身的医学和系统生理学问题是如何影响大脑的?
●大脑细胞和组织的哪些健康问题构成或导致了我们所定义的“自闭症”?
●特别是脑细胞和组织的健康状况如何影响大脑的电信号转导活动?
● 症状的缓解或恢复是如何发生的?大脑和身体的变化是什么?它们是像电影回放一样逆转吗?还是有不同的过程?

如何通过全身整体方法重新定义大脑在自闭症中的作用

我想要强调的中心议题是所有上面那些观察和思考对于我们理解自闭症大脑的意义。如果我们简单地假设自闭症是“天生”在大脑中的，并坚信它是无法改变的，那么我们也只能寻找“造就”了这种“天生”的基因，再寻求治疗方法来弥补这种情况。即便表观遗传学的实质是先天因素并不能决定机体的一切，(基因表达)会受后天的生理和环境里不利或有利的因素调节，但如果只从广义上而非特异意义上来使用表观遗传学这个术语，而仍相信最后的结果基本上是由先天因素决定的，那么把关注点(从基因决定论)转移到表观遗传学不会有什么差别。
但是，如果我们注意到大脑的途径并非完全是先天的，那么我们开始猜想并寻找它的灵活性和可塑性可能来自哪里。这让我们可以注意到并能够强化
大脑最大潜力的表现途径。

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我认为最大化大脑潜力最好是通过作用于大脑的全身方法完成。我的理由是，很多的转型来自大脑和身体的健康状况不同程度的转换—转变—改善全身系统的各个层面，尤其是大脑的功能。

大脑生物学和功能的多维交互作用

下面谈谈“基因-大脑-行为”模型是如何把一个非常复杂的过程过度简化了。
大脑与身体的问题具有相似之处
大脑所面临的挑战在很大程度上与身体其他部位的分子、细胞和组织所面临的问题有关。截至目前，大量的研究表明生物化学、代谢或能量产生过程可能在自闭症谱系疾病(以及各种其他慢性疾病)患者中以低效率或不平衡的方式发挥作用。细胞、组织和器官可能难以对有害物质进行解毒，或者难以清除其废物(例如错误折叠的蛋白质)。细胞膜或内部结构如细胞骨架(cy-toskeleton)、膜和各种其他细胞组分中的受体和通道可能在它们的结构或功能上存在问题。这些问题可能包括细胞膜脂质/脂肪组成的改变或损伤，其可能会导致僵硬或脆弱，阻碍了存在于膜中的受体和通道的正常功能，或者可能导致细胞膜泄漏而危及细胞内部和外部或细胞内部各个部位间的隔离，因为这种隔离是应该由膜来提供的。在更大范围内，人们的身体存在着屏障，例如肠道-血屏障或血-脑屏障，其结构或功能可能会在ASC(或其他慢性病症)中受损41-45]。细胞和组织功能、能量和抗改变能力可能由于炎性反应或氧化应激而被改变、耗尽或受阻。所有这些“全身”问题可能对大脑以及身体其他部分的细胞和组织产生影响。
真正地认识自闭症本身而不仅仅是其成因的一个关键点是，大脑不只是像身体其他部分那样只具有物理和生物的属性。如果自闭症纯粹是全身的 (例如免疫\胃肠道)而不是身体-脑整体的，那么很多才华横溢的人都会经受着过敏和胃返流的症状，而不是大脑的问题。我们需要了解自闭症产生的从身体到大脑的途径是什么。

大脑：物理和信息水平之间的转导

大脑是具有器官型功能和信息型功能的器官。虽然身体的其余部分也参

与能量和信息活动，但这些活动在大脑中具有更高、更复杂的水平。然而在我看来，大部分自闭症脑部研究的特点是对在这些水平间交互作用缺乏洞察力或混淆不清。
●一方面，我们有认知神经科学家寻找信息处理模式的差异或大脑活动定位的遗传相关性，而不考虑主要包括炎症、线粒体功能障碍或氧化应激的深层脑组织中的细胞、代谢和组织的问题。
●另一方面，我们有组织病理生理学研究人员十分细致地观察细胞和生物化学变化，但他们并不认为是这些变化实际改变了大脑的信息处理活动而产生了我们所称的“自闭症”行为。
当科研人员提出一种自闭症的全身途径的观点(即解决医学和生理问题，而不仅仅是使用行为和精神药物的干预)来提高自闭症患者的生活能力和质量时，我们所没有真正解释而是想当然地认为的是全身性干预通过为进行信息处理的细胞和组织形成更健康的环境从而帮助大脑更好地处理信息。
因此，我认为现在需要阐明这种联系。为了真正地改变自闭症的治疗策略，我们有必要在这两个层面之间搭建转化的桥梁。接下来，我将通过全身性途径的新视角来看待大脑以前观察到的现象。

大脑是一个身体器官：尚缺乏对其解剖学与病理生理学之间关联的探索

现已有对自闭症患者的大脑进行的多维解剖学观察，包括显微镜下观察已故自闭症患者的脑组织，以及宏观上使用脑成像技术，诸如磁共振成像 (magnetic resonance imaging,MRI),正电子发射断层扫描(positron emissiontomography,PET) 或单光子发射计算机断层扫描(single photon emission computedtomography,SPECT)。
这些观察结果显示了确诊的自闭症患者与其他被诊断或伴随神经症状发展的人之间的有趣的差异。然而这些现象被解释的方式往往可能更多地揭示了人们对这项研究的假设，而并非实际上正在发生的事情。从全身-大脑的角度来看许多结果需要被重新考虑，以前的解释需要被重新思考，因为我们对动态的病理生理学的理解是在不断深入的。下面将举例说明。
微观发现

细胞大小和密度随时间而变化

在微观水平上，几十年前就已知 ASC脑中的细胞可具有与正常神经细胞

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不同的形状或大小。如Bauman 和 Kemper 报道称，自闭症儿童的神经元可能比正常儿童的大，而成年自闭症患者的神经元比正常成人的小54]。原因是什么呢?虽然这些研究者最初提出自闭症是产前形成的，因为他们的研究发现在妊娠期第32周左右病童的边缘系统里的细胞比正常的要小，细胞的密度更高55,他们发现胎儿期这个细胞偏小和密度偏高的改变在出生后还持续很久，这使得他们提出在这些细胞中有些微妙但持续进行的变化，尽管他们没有具体说明这些变化可能是什么。会是炎性反应或氧化应激等过程在慢慢蚕食这些细胞的坚固性和抵抗力，并影响其功能吗?
神经元细小树突的密度差异

另外的微观发现也可能与慢性组织病理生理学对细胞持续刺激的影响有关。来自神经元的纤维称为树突，其具有或厚或薄的不同密度56。 SHANK3(该基因编码一个突触后的架构蛋白)突变使神经元树突的数量增加，这与神经元发放神经脉冲的能力降低并存——这可能是对导致突触活动下降的其他因子的补偿。抽搐和癫痫会改变树突的密度，这对神经元的刺激很大。锌缺乏在自闭症中相当常见5⁹,由此造成对突触里亲 SAP/Shank 架构的调节异常会促进自闭症的形成0]。诸如多氯联苯化合物(PCB)的毒物可能通过控制和扰乱调节细胞生长发育的信号而导致树突状纤维过多[61,621。因此，来自环境风险和基因造成的生理改变可以导致这些微观变化的发生。
神经元以外的因素：神经胶质细胞

直至近期，研究人员将自闭症大脑的研究焦点几乎完全集中在神经元。直到过去一两年，几乎没有任何自闭症研究者撰写的论文甚或摘要是提及胶质细胞。胶质细胞是包括星形胶质细胞、小胶质细胞和少突神经胶质细胞的一组细胞，其数量加起来超过大脑中神经元的(4～10):1,并且参与许多重要的代谢、免疫和信号传导功能。虽然这些变化可以改变基因表达，但尚未确定它们是由基因引起的。那些影响可能与遗传因素无关。
蛋白质废物积聚在大脑中

某些蛋白质存在堆积，如脂褐质或淀粉样蛋白73,74],说明这些蛋白质生成增加(例如来自兴奋性毒性、癫痫或氧化应激),或它们的清除出了问题，或两

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者兼而有之。这种异常的蛋白质堆积已经通过几项自闭症患者脑组织的研究得到证实。从脑中清除废物的过程可以通过多种途径如自噬，该过程可以受到包括氧化应激等在内的因素调节或阻碍已经在许多自闭症患者身上得到了证实。此外，它还依赖于这些细胞废物或“垃圾”通过最近命名为 “glymphatics” 的流体通道(此名由g+lymphatics组成，lymphatics 是淋巴系统，g 是 glial 也就是胶质细胞的第一个字母，因为它们是大脑胶质细胞上微小的流体通道)输送出大脑。尽管对于自闭症人群大脑的流体排出物知之甚少，但最近一篇发表在Science(《科学》)杂志上的文章报道称，睡眠驱使成人大脑的代谢清除80〕,睡眠期间的胶质收缩导致细胞间空间增加60%,在很大程度上提高了睡眠期间的流通量和淀粉样蛋白清除，这正是大多数ASC 患者难以进行的功能。在阿尔茨海默症等神经退行性疾病中异常物质如β-淀粉样蛋白堆积，我们逐渐认识到这些glymphatics 的流体通道(类淋巴系统)的功能较差使得错误折叠蛋白无法从脑中恰当清除，这加速痴呆或其他神经退行性疾病的发展81]。
宏观发现

区域大小的差异

在宏观层面上，众多解剖学脑成像研究测量了大脑各部分的大小，发现了自闭症患者的部分脑区较之正常人更大或更小82,83]。但研究之间的不一致造成了很多混乱——如一个研究中自闭症患者的脑区可能较大，另一个研究表示其区域较小，第三个研究又称其脑区不存在差别，特别是对年轻人和老年人进行比较的研究表明这些差异是随着时间而改变的——大脑的不同区域以不同的方式发生变化，有的随着时间变得越来越大，有的却变得越来越小。这些脑容量差异是否开始作为细胞功能的损伤，只有后来的改变导致宏观可测量的脑部结构大小或性质的变化?这个问题在自闭症大脑研究文献中几乎没有被研究。然而，整个脑部区域的大小只不过是该区域中所有细胞、血管、液体和细胞外“物质”大小的总和。因此除了遗传学或高强度活动外，任何这些组成部分健康状况的变化都可能是造成整体区域大小差异的原因。
大脑整体性增大

最为耐人寻味的发现之一是自闭症患者的大脑平均比正常人更大，特别是在年轻的自闭症患者中，但这种尺寸的增加不能简单地归于任何一个区域的大小86],尽管白质的增大对于整体尺寸的增加似乎要比对灰质增大贡献得更多。在大脑尺寸增大和炎性反应现象之间有惊人的相似之处，但另一

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方面对确诊的自闭症患儿的大脑炎性反应的直接记录很少，因为他们的病死率和死后大脑捐作科研的比率都很低。儿童脑成像或许能够帮助我们研究大脑的炎症反应。脑成像技术里要检测儿童脑炎症反应最好的方法莫过于用磁共振波谱成像来推断，但幼童必须使用镇静剂才能做此检测。 PET 的研究近期才开始进行，其主要由于技术的风险和注射放射性配体的需要而基本上只对成年患者进行检测。许多人认为大脑的炎性反应可能是引起 ASC的主要原因，他们觉得脑容量的增加可能是源于小胶质细胞，如果大脑的增大同时也是、或者完全是源于星形胶质细胞甚或是细胞外基质中的液体积聚，这则会与他们的观点一致。然而，它似乎并非来自于更高密度的轴突(神经元在短距离或长距离间发出的连接到其他神经元的纤维)。相反地，这些纤维在许多环境中已被测量呈现较低的密度91,这是几个反对将自闭症大脑容量的增加归因于神经发育早期神经系统修剪的失败的论点之一。
对全身-大脑理论的重点总结

总的来说，我们对大脑整体和脑区大小的宏观变化与细胞、液体以及大脑中其他物质的微观变化之间的关系了解甚少，即使大部分推论是可能成立的，其也超出了我们能够坚信的范围。即便如此，到目前为止有以下几点我们可以以整体的视角从自闭症患者的大脑中观察到：
●发现自闭症患者的大脑更大表明了“越大越好(或健康)”的假设并非总是正确的，尽管目前尚未有很详尽的解释。
●除了神经元之外的细胞类型以及除脑细胞之外的组织类型(例如血管、体液、细胞外基质)的贡献，可能有助于解释我们看到的现象是如何发生的。他们甚至可能帮助我们确定健康改善策略，可以为组织提供实现其修复能力所需的资源。
●这种与自闭症状相关的广泛的脑部扩大现象，对那些假设用于诊断自闭症的特定行为必须定位在与某些脑功能相关的特定脑区的人来说是困惑的。而对那些认为行为是从大脑区域动态的相互作用中产生的人来说这是可以理解的。因此，这又过渡到了考虑大脑的“其他生命”——信息处理，以及生理和信息功能的相互作用。

大脑是信息处理的系统

大脑不仅仅是一整套在脑脊液里新陈代谢着的细胞，也是一个处理信息的器官。许多不同类型的细胞和组织参与新陈代谢、电信号传导、能量学和物理信息处理。尽管通常没有说明，但是这些细胞类型中的每一种执行其作用

的能力取决于细胞结构和功能的完整性，用于生物化学反应的营养前体的供应和细胞完整性的维持，以及有害物质的清除(例如，有毒物质、促炎细胞因子或其他代谢物)或其他影响(例如，干扰平滑功能的辐射)。
在针对大脑信息处理的研究领域(称为认知神经科学)中，很容易就： ①陷入只对一种信息处理活动水平的思考，而忽略了同时进行的所有其他水平上的信息处理，其实所有这些属于同一总的过程；②忘记了使得该信息处理成为可能的相关的组织基质。因此我们要记住，从神经元间的突触— 包括所有的使得这些成为可能的相关过程，到通过沿着神经纤维束传导的聚合信号，信息处理是许多级别活动的结果。它也涉及与神经胶质细胞以及神经元功能相关的一波又一波的神经电活动。它还涉及血流的调节。虽然众多科研工作者的一生职业就是研究这些过程，看似各做各的研究，但实际上他们的工作是相辅相成的，涉及大脑的方方面面，最后整合起来揭开大脑的奥秘。从整体的脑-身体健康的角度来看，所有个体和群体都依赖于相关的细胞健康和完整性。
下面总结了目前重点关注的领域。

通过神经纤维束的“结构连通性”
我们知道神经元通过突触彼此沟通；我们也知道神经小纤维束或轴突束汇聚成更大的神经纤维束将大脑的一部分连接到另一部分。(校译者注：原文的 processes 不是“过程”都意思，而是神经元上延伸出来的细小纤维，通常包括树突和轴突；但这里指的是轴突。另外虽然 bundles 和 tracts 在中文里都翻译成“束”,但tract 要比bundle 大很多，一个nerve tract 里可以有许许多多bun- dle。)我们使用称为扩散张量成像(diffusion tensor imaging,DTI)的 MRI技术检测自闭症患者和正常人之间纤维束的密度、扩散率及其他性质的差异。目前在自闭症认知神经科学的研究中盛行通过这种方式探究结构连通性，之后将对其与fMRI测量的相关性进行讨论。然而，尽管很容易推断这些结构变化 “导致”了自闭症，但纤维束并非大脑传递信息的唯一途径。此外，这些纤维束的变化很可能是由几个因素造成的结果。这些因素不只是基因，同时也包括在细胞水平上最基本的慢性、持续刺激性的病理生理变化。(校译者注：原文的“downstream”是指纤维束的变化是那些“factors” 造成的，也就是说那些因子是“upstream”的原因，而纤维束的变化是downstream 的结果。)尽管目前着重于技术上比较容易做的神经纤维束的测量，相关的细胞水平上的功能紊乱，而非神经束的松弛度，可能是造成自闭症行为更基本的原因(下面会进一步讨论其机理);神经纤维束的变化只是那些更基本的细胞水平上问题的继发性表达。

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在大脑的活动时被激活的特定脑区
ASC患者在fMRI中激活(或“点亮”)的大脑区域显示出与正常人有所差异。正常人脑区的激活似乎与完成任务的相关性更一致，而ASC患者在大脑执行相同任务时与正常人的差异可以是“千差万别”的(即，每个人“点亮”不同集合的脑区)[⁹3]。这表明在大脑活动中可能没有一种“自闭症模式”。相反地，这可能意味着不存在真正的“自闭症”,而更可能是失调的过程造成了多种影响——这是过程本身而不是其创造的模式(即在任何情况下可变度都很大),这才导致了我们所谓的“自闭症”。
通过fMRI 检测激活大脑的组织水平因素
通过fMRI 研究检测由脑血流量和氧合作用差异引起的大脑激活94,95]。这些差异不仅由神经元的生理活动所致，其他细胞和组织，包括星形胶质细胞和血液脉管系统也有贡献。截至目前，除了一些研究注意到星形胶质细胞处于炎性状态以及其标记物如GFAP(胶质纤维酸性蛋白)在大脑尸检标本上升高，提示神经胶质细胞增生或激活和应急反应造成的细胞损伤外，星形胶质细胞几乎没有在自闭症研究中得到关注。
星形胶质细胞具有围绕大脑毛细血管的“足突”,并且是血脑屏障(Blood- Brain Barrier,BBB)的一部分。虽然我们知道有星形胶质细胞被“激活”并且有参与大脑炎症的趋势[如Vargas 等人在2005年简要提及的上述免疫改变，比如Vargas 等人(2005)关于神经炎症的开创性文章],但我们并不清楚组织病理生理学如何对我们在fMRI研究中检测脑血流量变化产生影响。
由于大多数从事自闭症fMRI 研究的科研工作者对大脑炎性反应或自闭症的其他脑组织现象不感兴趣，故其很少探讨星形胶质细胞的炎性反应和其他影响，以及星形胶质细胞如何对fMRI 检测的大脑激活模式产生影响；这些 “认知神经科学”的研究人员主要关注的是神经认知信息处理水平，并不太关注使这些信息处理活动成为可能的相关的细胞生理活动和细胞健康状态这些先决条件。鉴此，研究人员更有可能直接将他们的发现与遗传学相关联，而跳过了大脑病理生理学这一巨大的中间领域以及大脑病理生理学是如何在干预细胞在信息处理过程中起作用的。
脑组织的血液灌注问题
除了fMR 以外还有其他一些技术能检测与血流量或灌注量相关的脑活动，如PET 和SPECT扫描。许多这样的研究显示自闭症患者的血液灌注比正常人要差，但在不同研究中显示的血流量不佳的脑区并非特别一致[83】。我们

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对由这些脑成像技术检测到的自闭症患者脑部的血流量变化与造成这种变化的大脑组织的健康情况和其功能之间的关联几乎一无所知。其中一个原因是使用这些技术的自闭症研究人员通常更倾向于将脑血流量的改变与心理功能相关联，而不是与细胞和组织的改变相关联(并且这种改变在任何情况下都没有长期稳定地存在于自闭症图谱上，也并非很容易检测)。
电振荡或“脑电波”
大脑还产生电振荡波，其以复杂的方式彼此同步或不同步，并且在大频率范围内振荡[971。我们开始探求这些振荡在自闭症患者与正常人之间有何不同，其差异取决于振荡的频率不同。由于这些类型的脑波不仅限于沿着这些神经纤维束传导，故其差异无法直接映射到我们已在纤维束结构或密度中找到的差异。代表突触活动聚集的突触和脑波的产生有赖于相关的支持系统，包括能量产生、血液流动、废物处理以及神经胶质细胞平滑且精确地支持和微调神经元生理活动的能力。
通过时间与空间分辨率的检测而逐渐发现自闭症是一个“过程”
神经元之间的突触放电发生在毫秒——千分之一秒的时间帧中。脑波振荡也以毫秒为单位测量。在人类研究中可以通过EEG(脑电图)或MEG(脑磁图)方法进行检测，但不能通过fMRI、PET 或 SPECT 进行。fMRI 具有比PET 或SPECT更好的空间分辨率，在其解剖定位中比那些技术更清晰，也是无创的 (通常不需要任何注射)方法。但其时间分辨率很差。它的普及使用常常与自闭症是固定特质这一主导观点联系在一起(使用的普及常常和自闭症是固定不变的这一主导观点齐头并进);我们可以通过使用EEG 或 MEG检测微秒间的变化，这是有助于我们更好地了解自闭症是一个持续的动态的“过程”。 “过程”这个想法是重要的，因为如果电振荡和突触活动发生在毫秒级别(校译者注：所有神经电活动里最快的动作电位也需几个毫秒；突触延迟最短的也需4个毫秒，所以电振荡和突触活动不可能发生在毫秒范围内),一些相关的分子信号传导、化学、能量学和量子物理过程会以更快的速率发生[98】。这对我们如何看待造成自闭症的多维度相互作用，以及我们如何对自闭症的研究进行更有益的思考具有重要意义，下面将进一步讨论。

分子和细胞是大脑信息处理的基础

支持大脑功能的基础系统：细胞类型之间的差异
通过在动物脑中放置探针以检测大脑特定细胞类型或细胞层活动的研究

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我们发现，不同类型的脑细胞产生不同类型和频率的振荡。但由于我们不能将探针置于活体人脑中进行类似的测量，通过EEG 或 MEG 检测产生这些信号的大脑细胞的状态或者不同类型细胞的健康，我们只能据其大脑振荡的差异做出有限的推论。然而，即使我们无法精确确定哪类细胞出了问题，出了什么问题，从机体-脑的角度出发我们仍然可以寻找相关支持系统出现问题的迹象(如抗氧化剂不足、必需脂肪酸供应不足或胰岛素作用降低),或过度暴露于可能影响最优功能的物质或过程(例如自由基、毒物、促炎细胞因子和辐射)
支持大脑功能的基础系统：间隙连接和电压门控钙通道
星形胶质细胞通过它们的间隙连接产生的钙波是大脑中传递信息的另一种方式。间隙连接实际上是通过相邻细胞膜的微小通道，其在大量星形胶质细胞之间形成物理连续性。化学物质通过这些通道产生钙波，涉及大脑振荡以及在大脑特定区域中进行活动量的调节，目前不仅是在自闭症即便是在正常大脑里其发生的机理尚不清楚。间隙连接的功能可以被与病理生理学相关的其他因素调节，如错误折叠蛋白或体液过酸。在自闭症和其他一些病症里，星形胶质细胞被激活或参与神经炎症过程，但我们对这种病理生理学如何影响大脑信息处理所知甚少。
示例：大脑炎性反应对大脑信噪比可能的影响
在之前的章节中提到，星形胶质细胞在神经系统的不同层面发挥作用。星形胶质细胞在突触调节、在大脑里传播化学分子产生的信号、毛细血管腔口径、维持血脑屏障的完整或造成血脑屏障的损伤、支持神经元的代谢以及更多方面发挥作用。现在让我们将星形胶质细胞在调节兴奋反应中的作用添加到以上列表中。谷氨酸是神经突触的兴奋性神经递质，通常在突触信号传输后被星形胶质细胞清除，但星形胶质细胞被激活或发炎时无法有效地进行这项工作。这种病理生理学诱导的功能丧失可能是ASC患者大脑信息处理差异的主要原因，但这种细胞功能障碍、生物化学与信息处理之间可能的关系却几乎没有受到什么关注。
如果由于活化的星形细胞无法进行其清理工作而使得谷氨酸继续留在突触周围，那么谷氨酸将继续刺激神经元反应。神经元无法区分由谷氨酸过载产生的持久性信号(或其他由整体环境异常表达产生的兴奋性毒性或促炎性物质)与来自环境的信息含有信号，其通过感觉系统进入大脑。这种“谷氨酸过载”会导致系统中“噪声”的增加。此外，这些阻碍突触后谷氨酸清除的相同的病理生理过程也可能降低轴突周围的髓鞘完整性。影响髓鞘减少了大

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脑轴突线路系统周围的隔离，这可能进一步降低信号的质量和速度，并进一步增加系统的“噪声”水平。
在工程学中存在一种通用比率，即“信噪比”(“signal-to-noise”ratio,
SNR),表示系统中信号的质量。更多的信号意味着更好；相反(即，较少信号) 意味着系统运行不佳。以我们所熟悉的手机信号为例：具有5个接收条的手机具有良好的信号，但仅有两个接收条时你会得到很多静电(即噪声)并且信号有所减弱。伴随着这种低SNR, 噪声淹没了信号而使其很难具有一个有效的对话。
自闭症的一些电生理研究已显示出其具有更大的功率和更少的信号一致性，这是降低的信噪比的证据104-107]。虽然仍需更多的跨学科研究，但这个证据可以很好地反映基础细胞病理生理学对大脑保持其电信号强大和组织良好的能力的影响。
上述星形胶质细胞功能不全的情况也将增加“兴奋/抑制比”(excitation/ inhibition ratio,E/I ratio)。大脑需要保持兴奋和抑制之间的平衡，使信号量“恰到好处”。因为这种整体的病理生理过程增加促炎症和促兴奋性过程并同时干预抑制过程，所以它倾向于增加 E/I 比率的同时降低信噪比(SNR)。
因此你会得到更多的噪音和更少的信息。这种超负荷的倾向可能是ASC行为表现的合理基础，如注意力持续时间短，更易崩溃和感觉烦躁，以及睡眠问题和易发癫痫。然而，尽管自闭症和其他神经科学领域里的研究者对这种改变的 E/I 比率非常感兴趣，但他们仍然认为改变必须来自基因，他们很少考虑多层次生物学中其他部分的可能的影响，特别是包括这些基于细胞环境调节的病理生理过程等相当合理的影响因素，这点仅从以上简短的讨论中就可以看出。

自闭症研究的捷径：从由下到上到由内到外和多维方法

我觉得在自闭症研究中，“由内到外”的方法与多层面方法相结合,而非“由下到上”或“由上到下”的方法，能使我们更快地找到帮助自闭症患者的有效方法。由下到上的方法认为基因和分子“造成”一切；由上到下的方法认为在自闭症里行为治疗是最好的治疗。由内到外的方法与多层面方法在生理学和系统生物学的文献里已有越来越多的讨论。
生理学和新陈代谢专家们已经把“由内到外”的观点诠释得很清晰了。英国肌肉生理学家DenisNoble 在他的著作《人生的乐章：基因组以外的生物学 (TheMusicofLife:BiologyBeyondtheGenome)》中表达的观点最有说服力10]。“由内到外”的观点强调所有“作用”是发生在生理水平上的。多层面

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方法强调在上面讨论过的所有不同的生物学层面中，在许许多多生物活动之间同时发生着复杂的相互作用1,112]。从这个角度看，基因会影响生物系统的发展偏向某个方向——基因会使其强壮和让其脆弱——但基因绝不是唯一的影响因素，所以你不能确切地说完全由基因“造成”了某些生物事件。
这个观点在文献中也逐渐显现，即基因和环境是如何特异地相互作用的。钙通道功能障碍在这个方面提供了一个受到特别关注的例子。人体有许多与自闭症相关的能够改变钙通道功能的基因，目前已知道环境以及遗传途径对钙信号传导功能障碍的影响。Stamou 及其同事在2012年的一项研究中指出，一旦某基因突变与某关键信号通路改变有关并造成自闭症风险，则化学品或其他环境因素如果影响同一信号通路的话也会同样造成一样的风险。这些作者回顾了找出汇聚到细胞内共同信号通路多个机制的策略。这些细胞内共同信号通路与这些通路/机制有关：钙依赖性的机制，受细胞外信号调节的激酶(ERK)/磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K) 通路和突触的一些结构蛋白(如连接突触前、后的连接蛋白neuroligin 和 neurexin;突触后架构蛋白shank) 。 (校译者注：原文把三个蛋白大小写混在一起似乎有点小错。如果是小写，那是蛋白质；后面的shank 应该也是小写；如果是SHANK那是编码这个蛋白质的基因。编码neu- roligin和 neurexin 的基因写法是NLGN 和 NRXN) 。由此来看，似乎没有特别理由要给予基因突变对钙信号通路造成的干扰比别的影响因素更多的权重，因为不管是钙信号障碍是基因突变造成的还是化学毒素，或电磁场干扰造成的，其最后对功能的影响是没什么差别的，因为都是直接通过钙离子通道生理改变来实现的。
Stamou 等在2012年的研究便是很好的一个由内到外思维的例子。他们阐述的核心是“正由于钙通道的功能障碍才造成了自闭症里的功能改变”。基因和环境触发因子本身都不直接影响大脑功能。在这两种情况下，正因为它们对“生理过程的影响”才造成了大脑(和其他)功能的变化。

另一个问题是：异质性——为何会有这么多导致“自闭症” 的途径?
钙通道功能障碍不仅为由内到外思维提供了一个很好的例子，它也为自闭症异质性的讨论提供了很好的指向。虽然有一些自闭症患者可能存在钙通道功能障碍，但另外一些病人则可能没有这个问题。从遗传综合征的水平上看，在已知的100多种症状各异的综合征里，自闭症是一种共病1¹5¹;尽管

390    ASD 的个性化治疗和一生不同阶段的议题

在与这些病症相关的遗传问题中存在一些共性，但仍有许多是我们目前不清楚的。许多人偏向于称自闭症是突触引起的疾病，但这实际上是一个相当模糊的表述，因为突触是非常复杂的，涉及数量巨大的蛋白质、神经递质、受体和不同类型的细胞(不仅是神经元，而且有星形胶质细胞)以及血管、血流和细胞外基质之间的相互作用。如果只是突触功能障碍而不是造成这种功能障碍的根源，由它更直接地导致了造成自闭症的大脑及行为上(和生理上)变化，则突触问题甚至没有什么特殊的理由需要从基因突变衍生出来。科学家们目前提出了三方突触(神经元、星形胶质细胞和血管)。突触功能障碍可以来自于这个系统中的任何一个组分。
即便在此，有很多可能会导致突触功能障碍的原因，我们不是正面临着 “先有鸡还有先有蛋”这个问题吗?也就是说，当一个具有许多相互作用组分的复杂系统改变了其运行动态时，你如何确定哪个“原因”是“最先出现”的? 抑或这样做是有意义的吗?

那么,到底什么是“自闭症”呢?

在回顾了十分复杂的多层次的自闭症生物学之后，如果再回到“自闭症是一种源自大脑发育遗传改变的行为综合征”这一原有假设上，我们会感到我们不仅丢了芝麻更是丢了西瓜。相反地，人们会对所有这些对人体，尤其是对大脑的各种多层次的挑战，以及在不同自闭症个体里这些挑战的不同的组合是如何积极地造成了符合自闭症诊断标准的行为这样的过程惊叹莫名。

自闭症作为一个被改了许多“设置”的系统的突发事件

正如前面所提到的，一些神经认知学者提出，自闭症的许多特征来自于在认知层面上的复杂信息处理的困难。为什么系统会有这样的困难呢?我们从多层次系统生物学的角度来思考更容易些。在炎症、线粒体功能障碍和氧化应激，或是钙通道功能障碍状态下工作的细胞，会丧失适应性、流动性或响应的快速性，其可能会以最复杂的方式耗费系统的资源来协调信息。甚至有可能出现一些神经元会因为受到太大的挑战而“离线”(不工作),这样它们可以存活下去，而不是当他们没有足够的线粒体或星形胶质细胞提供能量或恢复其代谢完整性时损害自身。
2008年Anderson 在一篇有关自闭症的发生颇有思想性的文章中指出，各种“自闭症相关现象包括智力障碍、癫痫、持久性原始反射、刻板印象、自残行

第21章全身方法对自闭症脑部健康转化的影响：新陈代谢和电生理之间转导的神经可塑性机制    391

为、学者能力和形态异常等”可能是自闭症的早期特征。作者认为“应该补充通过一个简化的方法来思考自闭症行为及相关现象，这可能有助于阐明自闭症的组分和复杂性。”
上文所述的多层次系统方法为这个观点提供了更多的资料和支持。此方法支持这样的观点，即一个在经受各种细胞水平挑战下工作的生物系统可能会造就自闭症行为，这是因为当大脑在必须节约其资源时它就会这样做，否则它就不能掌控和协调足够的资源来以最佳方式完成其工作。
这里的一个讽刺且大胆的转折是，对系统的有些挑战，如谷氨酸浓度的增加(例如由于被激活的星形胶质细胞在突触释放谷氨酸后未能将其从突触间隙清除)可能会提高敏感性、智力甚至提高感知敏锐性。的确，已有记载称一些 ASC患者与正常人相比在这些方面具有更佳功能(有时这可能表现为特殊的技能、有时表现为优越的感知能力、有时表现为伟大甚至绝妙的天赋)。在这一点上只是推测，将这些神经心理学层面的发现归因于其神经生物学基础；但即便如此，这个有趣的假设是值得验证的，因为它联系着ASC患者身上不同且看似矛盾却明显共存特征。
从“什么导致了自闭症”到“自闭症是如何造成的”
当我们越过遗传决定论到多层次生物学这种由里向外的方法时，我们看到自闭症不是固定的“自闭症存在状态”而是相互作用的复杂过程变化的结果，与正常人相比，在ASC 患者中这些相互作用的复杂过程以不同速率、不同平衡或设定点进行。这可以包括独特的细胞转运、体液转运、线粒体代谢、免疫应答、肠道蠕动或电生理振荡的过程，或所有这些过程和谐一致的改变。
由于有很多因素(包括营养、活动和环境因素)调节这些过程，因此可以想象导致自闭症退化过程的原因可能是逐步改变这些内在过程工作方式的连锁事件。
同样，从这个角度来看，当这些内部过程的变化沿着与它们在退化改变的相反方向进行时，自闭症的症状会得到改善甚至消失。
从“自闭症是如何造成的”到“自闭症是如何工作的”:接近动态过程
从这个角度来看，我们的目标不仅是要超越一个静态的观点(这个观点认为一个特定的基因、一种特定的毒素或特定的基因-环境相互作用可能“导致” 自闭症——即单独地将一个系统从没有自闭症转向到自闭症),并且推进到一个动态的理论体系，在此体系里我们看到自闭症是如何从大脑及整体以生理为中心的多层次系统作用中演化而来的。

自闭症源于对支持大脑电活动的细胞本身的异常电生理即时即刻的冲击

从这个角度来看，我想提议我们称之为自闭症的症状是源自即时即刻进行的生理过程，而不是大脑回路中某种先天差异的产物。因此，回路中的差异会在发育期间出现或扩大，而不是天生的。
具体来说，电生理振荡构成了大脑活动的基础。它是从相互关联的许许多多单个突触活动中组成的总的模式。已知至少有大量的自闭症患者的生理状态改变是由细胞的电生理学产生的，因此，自闭症可能会从群体和个体间异质的生理变化阵列中出现，且汇聚在组织生理学和电生理学的交集上以产生变化。这种生理上发生了改变的系统造成的结果就是我们所称的自闭症行为。
显然，这并不排除有些自闭症患者主要是由遗传改变所致，但它确实帮助我们认识到为什么在大多数自闭症患者中没有发现这种基因，以及为什么即使在ASC 个体间也是各异多变的。
也就是说，即使在存在严重遗传性易感的个体中，也仍可能通过环境因素来调节使情况恶化的细胞功能障碍也就是，即使基因突变本身是难以改变的，我们仍能通过改善细胞功能来缓解病情。

进行研究和临床护理的实际意义是什么?

如果我们可以根据经验建立组织病理生理学与电生理学改变的联系，我们将能够把自闭症研究的重心从寻找以自下而上的方式“导致”自闭症的基因或环境因素，转移到去寻找我们可以调节并且能被纠正的致病原因。我们将不再投入大部分资源去无尽地寻找自闭症基因，押注于识别先前的因素(遗传或环境)是取得进展的唯一途径这一假设。相反地，我们会发现有许多可以调制机体功能的切入点。
大脑的生活方式干预：公众健康含义
尤其重要的是系统生理学和电生理学之间的零接口，因为通过调节生理机能我们非常可能在电生理学及其产生的行为做出实质性的改善。
在某种程度上，病理生理过程如炎症、氧化应激和线粒体功能障碍共同影响电生理活动以及产生这些活动的突触功能，这是好消息，因为我们已经可以通过许多可行的方法来影响这些类型的功能障碍。其中突出的方法是日常生

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活方式的改变，包括最佳的高质量营养的饮食、运动和良好的睡眠卫生。高营养密度的食物，充满了抗氧化剂和高质量脂质，可以抗炎、减少氧化应激以及恢复线粒体和器官系统功能甚至具有神经保护作用。而睡眠不足、压力和缺乏运动会产生促炎反应，改善这些方面是有助于恢复健康的[¹22]。
面对像自闭症这样严重的事情，谈论这些日常干预可能看起来很微不足道。但是，通过观察自闭症患者的日常生活发现，他们的特点往往是自我限制的饮食，十分缺乏水果或蔬菜并且严重营养不良[123;他们经常睡不足更不用说让整个家庭都无法入睡；他们基本很少运动并且总是感到压力。这些都是不健康的，只要我们意识到这与生理和大脑健康息息相关，那么一切都是可被改变。在上述这些生活方式的几个方面里如能做出更好的选择的话，我们可能会减少自耗并改善对脑部保养和修复功能。

用公共健康及良好的日常生活方式来治疗自闭症

这真正意味着，我们需要用一个公众健康方式来干预自闭症，并强调实现生活方式的干预，这至少对于大多数自闭症患者的生活质量有一些改善，并且对于相当一部分人有很大的改善。事实上，鉴于自闭症患者人数的增加和花销的上升，我们真的不得不采取这种方法。

未来方向：走向真正的转化研究

因此多层次生物研究的重要性不仅在于它能够教给我们什么新事物，并且在于展示了旨在通过公共健康日常生活方式的改变来调节基因的表达的方法不是非理性的而是势在必行的124]。
因此：
1. 从研究的角度来看，我们需要采用多层次系统生物学方法，通过协同项目来整合大脑、行为和病理生理学研究。这样做的一种方式是，勇于创新的临床医生对系统性生理学进行干预，以观察其如何影响大脑电生理学和代谢[分别通过EEG( 或MEG) 和磁共振波谱分析(MRS)] 。这种类型最优数据的生成，可能来自接受了密集和成熟综合治疗个体的生理学的多个方面的预期多系统样本收集，且与动物模型构建并行。
2. 通过采用多层次研究设计呈现ASC 转化问题，真正针对大脑电生理和代谢之间的相互作用，我们将获得一个系统水平和机制特征的转化，即从多到少(退化)或从少到多的选项(恢复)。(校译者注：这里的退化和恢复特指自闭症症状的出现和消退。作者在前面多处地方讨论过)这可能有助于我们重

新设计更有效的治疗[99,100。
3. 要做到这点，我们需要一个体制来收集来自学术研究和基于社区临床环境的数据，并且要让这些拥有不同实验技巧和实验装备的团队以有意义的方式进行合作。
4. 通过这种方式，我们可以进行从“病床到实验室再回到病床” (“bedside-to-bench and back”),也就是“临床-基础-临床”,这样的转化研究，这可以更快地改善成千上万自闭症患者的生活，这种改善也不仅延伸到自闭症病人的家庭，还能延伸到由于其他原因造成的病理生理学而使其大脑功能和生活质量欠佳的那些人的生活中。
5. 重要的是，我们可以把这些信息转化为对公共教育活动的支持。这些公共教育活动现在就可以启动；当本章所述的方法被越来越多研究所采用时，这些公共教育活动的内容就会更加丰富。

结论：多维动态生物学赋予了希望和力量

综上所述，基于多层次生物学的思考，以及产生自闭症的电生理过程可被生活方式干预法(此法改善自闭症的生理学基础和其基因表达)来调节这样的理解，我们用已有的知识足以作出很大的改变；我们要调动积极性和各种资源使之实施。

本章要点

●自闭症是通过遗传、环境、表观遗传、代谢、分子信号和生理水平之间的动态相互作用而逐渐形成的。
●遗传因素可能或强或弱地影响自闭症的形成，但即便如此也有其他许许多多互相重叠可影响自闭症形成的生理病变。这些病变或许是可被改善的：如果做出了好的选择，我们仍能提高病人的生理功能和生活质量。
●强调对大脑解剖特征的脑部研究并不足以帮助我们理解自闭症的形成或动态特征。
●许多脑解剖特征可能是慢性、持续性组织刺激的结果，而不是纯粹的遗传差异的结果。炎性反应、氧化应激和线粒体功能障碍对组织的持续性刺激尤为重要。
●大脑产生“自闭症”的“起点”可能在于组织生理学和电生理振荡之间的相互作用。
●在此“起点”的界面上存在着许多可能的干预途径，特别是通过“自上到下”

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或“由内到外”通过全身-脑的生活方式改变来改善细胞的健康状况。生活方式改变包括选择高质量营养、改善睡眠、减少生理压力和有害接触。
●从动态系统的角度来看，“自闭症”可以被重新定义为是由于产生振荡活动的细胞被耗尽或其他功能失常而时时刻刻影响大脑产生电振荡造成的。
●收集从全身干预引起生理和电生理系统改变的数据，这样的从病床到实验室的转化研究可以帮助我们通过逆向工程来找出从正常发育退化到自闭症关键转变的原因从而更有效地帮助患者进行恢复。
● 推行上述这些干预途径是一个紧要的公众健康问题，因为这可以减低病人不必要的痛苦且节省了巨大的经济开销。
● 用全身-脑方法来研究身体-大脑的转化是科学赋予的希望之源。

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第22章

争取自闭症的最佳疗效：治疗自闭症中或许可被逆转的情况

RichardE.Frye,DanielA.Rossignol孙睿睿孔健译，董存建孔学君校

摘要
尽管自闭症谱系障碍已被研究数十年，该病的有效疗法却十分有限。事实上，自闭症儿童可以经成功的治疗而得到最佳结果这一理念只是在最近才被广泛接受。近期研究证明，自闭症与几种代谢异常有关，这些异常包括线粒体、叶酸、氧化还原、谷胱甘肽、四氢生物蝶呤等代谢功能障碍。其中很多代谢异常可能会被对新兴疗法纠正，这为改善甚至有可能治愈这些定义自闭症的核心症状和相关的症状提供了机会。事实上，一些临床研究初步结果显示了治疗这些代谢异常的良好效果。
本章回顾了一些有望被治愈的代谢异常疾病，提供了治疗这些自闭症中出现的生理异常有效性的证据。虽然这些证据还比较初步，但它们为争取治愈自闭症患儿指明了方向。
关键词：线粒体功能障碍；抗氧化剂；谷胱甘肽；氧化还原代谢；叶酸；亚叶酸；叶酸受体α自身抗体；四氢生物蝶呤；一氧化氮；自闭症谱系疾病。

前言

尽管自闭症谱系障碍(autismspectrumdisorder,ASD)已被研究数十年，我们对该病的病因、有效治疗方法的认识仍有限。目前，治疗师对病患进行多年全职一对一治疗的行为疗法是唯一广为接受用以治疗自闭症症状的疗法。该方法不仅费用昂贵，且大多不在医疗保险报销的范畴，因此仅适用于少数自闭症患儿。目前，唯一被美国食品及药物监管局(the Food and Drug Administration,FDA)认

第22章争取自闭症的最佳疗效：治疗自闭症中或许可被逆转的情况    405

可的药物疗法是使用抗精神病药，仅能治疗自闭症相关的某一种症状，即易怒，而不是自闭症的核心症状。
自闭症谱系障碍患儿的症状能够被治愈这一点，仅在最近为人们所接受。过去，许多持怀疑态度的人根本不信自闭症的症状会消失的报道，他们将此归咎为最初误诊造成的结果。然而，近期一项多中心临床研究为有一些患儿的自闭症能被治愈这一观点提供了有力的支持。在那项研究中，参与研究的病童的早先的自闭症诊断由一位不知病情的医师独立确认。此外，另一项近期研究证实了自闭症患儿至少有6种不同的发育轨迹。这项研究分析了6975例自闭症患儿每年症状的改变情况2。总体来说，每组患儿的社交和沟通能力随着时间的推移均有所改善，病情轻者症状缓解情况优于病情重者。有意思的是，其中“绽放bloomers”组的儿童最初社交和沟通能力较弱，但在随后的几年里，症状改善十分迅速。上述这些研究表明，自闭症患儿的病症能被改善甚至消失。然而，为何部分儿童的症状得以缓解，而另一部分却不能，原因尚且不知。厘清所经受的疗法和获得最佳疗效二者之间的关系对于为自闭症患儿寻求最佳疗法至关重要。
自闭症研究从一开始便致力于遗传病因³研究，之后依旧如此；但事实上用单基因遗传和染色体缺陷仅能解释一小部分患者的病因41。事实上，近期一些研究发现自闭症患儿出现罕见的双亲所没有的新生基因突变，这表明可能是后天获得的基因突变而非维持DNA 完整出现错误，或遗传基因性综合征所致5,6]。随着自闭症领域的研究继续，大多数自闭症的病因越来越明朗，这可能与遗传性易患病体质和环境因素之间复杂的相互作用有关。诚如近期一项对异卵双胞胎的研究所推断的，对只有自闭症核心症状的病人来说，环境因素致病的风险较遗传因素要更高；但对那些伴有其他共病的自闭症病人来说，环境和遗传因素造成的风险则基本相同7。(校译者注：在这里作者对两大类自闭症作了区别：“autistic disorder”是指狭义上的自闭症，其主要症状就是自闭症的核心症状而较少伴有其他的共病，有时也被称为“典型自闭症classic autism”; 另一大类是更广泛意义上的自闭症，那些病人通常还伴有其他病症。)
近期研究拓宽了对自闭症相关异常症状的认知，认为这些症状与氧化还原代谢、能量生成系统受损等基本生理反应异常和调节如叶酸、谷胱甘肽和支链氨基酸,PTEN 基因突变26],Phelan-McDermid综合征27】,15q11-q13 重复综合征,安哥拉综合征,视隔发

406    ASD 的个性化治疗和一生不同阶段的议题

育不良综合征³¹]和唐氏综合征。
本章讨论了对治疗可能有效的与自闭症相关代谢异常存在的证据。通过探讨疾病相关的生理因果关联，提供证据佐证这些生理异常的严重程度与自闭症患儿病情严重性呈正相关，从而加以证实，这些异常实际上与自闭症的发育、认知和医学上的障碍相关的核心生理过程有关。本章还讨论了对这些相关的代谢异常行之有效的新兴疗法可有助于缓解自闭症的核心或相关症状。最后，我们指出，这些代谢异常及其相应的治疗是如何互相关联的。通过一些实例，我们旨在指明，通过治疗自闭症相关代谢异常，人们有望在发育、认知和行为方面争取最佳的结果。

新兴疗法的一些特殊代谢疾病

线粒体代谢功能障碍
最近一项分析发现，约5%的自闭症患儿符合典型的线粒体代谢功能障碍 (mitochondrial disease,MD)的诊断标准，而有高达30%或更多的自闭症患儿中发现与MD一致的异常生物标志物。由于这些生物标志物研究未探索这些患儿是否符合典型MD 的诊断标准，所以尚不能确定是否异常线粒体生物标志物的高出现率将会转变为自闭症患儿MD的高发病率。然而，最近研究显示，如在自闭症患儿重复检测线粒体代谢功能障碍的生物标志物时，在近一半的次数里会被测到，而这些生物标志物值的升高是MD 的有效标志34]。不仅如此，似乎这些生物标志物可识别不同的 MD 亚群患儿。因此，这些发现表明，MD生物标志物值异常好发于自闭症患者34]。近期一项研究对线粒体功能障碍可能的高发病率作了进一步确认，该研究对比自闭症患儿和典型发育期儿童淋巴细胞的电子传递链(electron transport chain,ETC)的功能,发现 80%的自闭症患儿的电子传递链的功能明显低于正常儿童，换句话说，是线粒体功能障碍。
因为MD 的诊断标准多样，所以如何评判伴有MD的自闭症患儿的比例较为复杂。大多数研究自闭症患儿总群体中出现的典型MD的发病率的工作采用了MD的一种生物标志物，即乳酸(lactic acid),以及结合了用于诊断 MD的修正后的 Walker 标准。使用修正后的Walker 标准有相当大的局限。具体来讲，该诊断标准偏重于电子传递链中的某个复合体功能的显著降低以及已知的线粒体DNA突变36]。然而，一项对所有报道出的伴有MD的自闭症患儿病例进行的回顾性研究表明，确诊为MD 的自闭症患儿中仅有23%具有已知的线粒体DNA突变，甚至有几例报道发现一些伴有MD的自闭症患儿里22出现

第22章争取自闭症的最佳疗效：治疗自闭症中或许可被逆转的情况    407
电子传递链中的复合体功能过度活跃而非功能降低。显然，仅仅依赖于修正的Walker 标准容易遗漏这样的病例。因此，Frye 和 Rossignol³9建议使用 Morava的标准40],即另一个常用的标准，该标准将MD 诊断过程的各个方面的发现纳入考虑，包括临床、代谢、影像、形态学发现等。与修正的Walker 标准不同，为了提供进一步制定MD诊断标准的指南，Morava的标准40综合考虑了某个特定病人的与线粒体相关症状的数目和实验室检查结果，以进一步确诊MD。
线粒体功能障碍与造成自闭症患儿认知发育异常的病理生理机制之间有相互联系。在自闭症患儿尸脑,因此对线粒体的功能尤为依赖。线粒体富集于树突、轴突，在产能、钙离子内稳态和突触可塑性中均发挥了重要作用。 GABA能神经元传导减弱可能在自闭症中尤为显著。GABA 能神经元对于高频γ节律的产生和同步至关重要，这个节律对感觉信息的高级皮层处理，和一些自闭症患儿中出现的“连接”异常极为重要51]。在因功能退化造成的自闭症的好发年龄，(校译者注：“autistic re- gression”或 “regression” 这两个词在自闭症文献里有特定的含义。它们指本来发育正常的婴幼儿在某个时候起逐步丧失了原先已学会的社交和语言功能而呈现出自闭症的核心症状，也就是所谓的“功能退化”。这通常发生在出生后的6～18个月里)皮层兴奋的谷氨酸能神经元传导递质和受体产生过量。因此，那段特定的发育时期正是最需要线粒体提供能量的时期。
线粒体功能障碍可能与自闭症一些功能障碍密切相关，因为与不伴有线粒体功能障碍的自闭症患儿相比，伴有线粒体功能障碍的自闭症患儿行为和认知障碍更为严重55-57]。除了影响脑功能障碍外，线粒体功能障碍还可用以解释自闭症相关疾病的高发病率，因为与不伴有粒体功能障碍的自闭症患儿相比，伴有线粒体功能障碍的自闭症患儿好发诸如胃肠病、癫痫发作和总的运动功能发育迟缓等疾病22]。
治疗线粒体疾病，包括服用抗氧化剂、辅酶Q10、L-肉碱、B 族维生素和生酮饮食等，可改善一些自闭症患儿的功能22]。包括两项双盲安慰剂对照62,63] 在内的几项研究，报道了采用L-肉碱疗法能够改善自闭症的主症和相关的行为异常。这两项双盲安慰剂对照研究发现，与安慰剂对照组相比，服用含B 族维生素、抗氧化剂、维生素E 在内的多种维生素和辅酶Q10 治疗能够不同程度地改善自闭症症状。其他几种抗氧化剂和肌

肽[⁶8],也被报道认为能够显著改善自闭行为障碍。一项研究报道了采用还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH) 和 D-核糖(D-ribose) 能够改善自闭症症状。最后，还有一项研究报道了采用生酮饮食疗法后，30例患儿中有18例其自闭症症状得到改善。因此，许多被认为能够改善线粒体功能障碍的疗法，被发现能有助于缓解一些自闭症患儿的症状，尽管其中有些在自闭症患儿上的研究并非针对线粒体功能本身，也不知采用上述疗法治疗这些自闭症患儿是否能够改善线粒体功能。即便如此，上述这些疗法代表了不良反应较小和可能会在自闭症里明显改善线粒体功能的疗法。
叶酸代谢
几项证据表明，自闭症患儿表现出叶酸代谢异常。有报道称，一些自闭症患儿里常见的基因多态性可明显影响其叶酸代谢。另有报道，编码甲基四氢叶酸还原酶(methylenetetrahydrofolate reductase),二氢叶酸还原酶(di- hydrofolate reductase)79和还原态叶酸载体的基因的多态性。自身抗体可与叶酸α受体结合而严重损害其功能。这些自身抗体被认为不仅与一些患有Rett 综合征的儿童。最近，Frye et al.8]报道指出，93例自闭症患儿中有60%显示阻塞型叶酸α受体抗体阳性，有44%患儿显示结合型叶酸α受体抗体阳性。叶酸α受体抗体的高阳性率被Ramaekers⁹6所证实。该研究者通过对比75例自闭症患儿和30例发育迟缓但非自闭儿童，发现自闭症患儿中有47%为阻塞型叶酸α受体抗体阳性，而对照组此阳性率仅为3%。
叶酸代谢的缺陷可解释与自闭症相关的某种特定的异常。例如，叶酸代谢不足可导致氧化应激反应过度和甲基化功能不足，这是在一些自闭症患儿出现的全身性和大脑里的两个主要异常13,97,98]。几项报道认为，某些特殊的自闭行为与叶酸代谢异常有关。例如，自闭症患儿的异常躯体活动、好动或自残行为。

第22章争取自闭症的最佳疗效：治疗自闭症中或许可被逆转的情况    409

或许最令人信服的能够证明叶酸代谢和自闭症行为有关的证据是针对中枢叶酸异常的儿童用还原态叶酸对其进行治疗后取得的很好效果。例如，有记录表明，许多自闭症及伴有脑内叶酸缺乏的儿童在使用还原态叶酸治疗能够显著改善其临床症状。这些还原态叶酸通过其相应的载体而非靠叶酸α受体转运系统穿越血脑屏障。几项个案和系列病例报道。另一研究观察了23例功能退化形成的自闭症并伴有脑内叶酸缺乏的儿童，有2例年龄较小的患儿自闭症及其神经系统症状得到完全康复，3例年长患儿其神经功能缺损症状得到改善，但自闭症症状无明显改变，其余患儿的神经系统症状、部分自闭症症状，尤其在社交能力方面，均得到改善。这表明，脑内叶酸缺乏至少在自闭症某一亚群患儿里可能是个可逆转性病因。
近期，Frye⁸1研究发现，对于两种叶酸α受体自身抗体中至少有一种为阳性，但未必为脑内叶酸缺乏的自闭症患儿，采用亚叶酸治疗能够改善其症状。 44例至少有一种叶酸α受体自身抗体为阳性的自闭症患儿，每日分2次摄入亚叶酸2mg/kg(亚叶酸日剂量最大为50mg), 平均服用4个月，由父母使用改进过的临床总体印象量表里的(Clinical Global Impression-Improvementsubscale,CGI)——症状改善亚量表，从患儿的言语沟通、语言应对、表达、非言语交流、刻板行为、多动性、情绪、注意力和攻击性行为等不同的维度来评估治疗的效果。其得分与自闭症患儿对照组相比较，对照组为等待测试患儿，且在相同时间的随访期内未接受任何治疗。研究结果发现，经还原态叶酸治疗的自闭症患儿，其言语交流、语言应答、表达、注意力和刻板行为均较对照组有显著提高，且没什么不良反应。对16例自闭症叶酸α自身抗体阳性患儿进行诊断性腰椎穿刺，以测定其在治疗前脑脊液中的5MTHF水平。虽然研究发现，脑脊液中5MTHF 水平与血清阻碍性叶酸α自身抗体浓度呈负线性相关，且无1例患儿脑脊液中5MTHF浓度低于正常范围的下限值，但所有患儿脑脊液中5MTHF 浓度均低于标准脑脊液中5MTHF的平均浓度。这表明，伴有阻碍性叶酸α自身抗体的自闭症患儿脑脊液中5MTHF 浓度可能低于正常值，与脑内叶酸相对缺少结果一致，更准确地说，是脑内叶酸不足，即脑内叶酸水平低于能够维持最佳神经元功能的叶酸需求量。事实上，一些研究者报道，亚叶酸疗法能够显著改善脑脊液中低水平浓度5MTHF患者的神经症状。这些发现表明，使用还原态叶酸疗法能够显著改善自闭症患儿核心及相关症状。
氧化还原代谢
几项证据显示，一些自闭症患儿出现氧化还原代谢异常。两项病例对照

研究报道，与正常儿童对照组相比，确诊为自闭症的患儿氧化还原代谢功能异常，这不仅体现在氧化二硫化谷胱甘肽的量显著增多，还包括细胞内主要的抗氧化剂和起解毒作用的谷胱甘肽(glutathione,GSH) 显著减少。(校译者注：GSH 是 GSSG的 reduced form即还原态，而GSSG则是GSH的 oxidized form 即氧化态；这种氧化-还原态之间的变化与上段里 folinicacid 和 folate 的关系相似。GSH 的抗氧化和解毒能力是通过它自己被体内的自由基或毒素所氧化而实现的。)自闭症患儿用于合成谷胱甘肽的几种代谢前体低于正常值，提示至少自闭症这一亚群患儿谷胱甘肽合成不足。不仅如此，从ASD 患儿提取出的新鲜外周血单核细胞，和经典的自闭症(即只有核心症状但很少伴发其他共病的自闭症)儿童提取出的淋巴母细胞的胞液和分离的线粒体中均发现谷胱甘肽缺乏。
研究发现，氧化应激的治疗对自闭症患儿有效。据一些公开标签的临床研究报道，甲基钴胺素(Methylcobalamin) 和亚叶酸(folinic acid)可显著提高自闭症患儿谷胱甘肽的浓度，且能够改善某些自闭行为。其他研究表明，谷胱甘肽代谢功能能够通过补充抗氧化剂、辅酶Q10 和维生素B,其他维生素和矿物质。有意思的是，近期一项双盲安慰剂对照研究表明，与安慰剂对照组相比，乙酰半胱氨酸能够缓解自闭症患儿的易怒情绪，提高其社交能力107]。乙酰半胱氨酸将被氧化的谷胱甘肽(即二硫化谷胱甘肽，GSSG)还原成谷胱甘肽，使其浓度增加。 (校译者注：乙酰半胱氨酸是个还原剂，它可以还原很多被氧化的分子，包括被氧化的谷胱甘肽。原文里所指的前体分子是指它广义上能增加谷胱甘肽的量。但从严格的生物化学意义上来讲，乙酰半胱氨酸并不能算是谷胱甘肽的前体。)尽管在后一个研究里没有直接测定谷胱甘肽的浓度，但这一疗法能通过氧化还原代谢的改善而具一定的疗效。有报道称，一些其他抗氧化剂6包括维生素C⁶7和肌肽[68,能够显著改善自闭行为，表明氧化应激治疗对自闭症患儿有益。综上所述，这些研究表明，氧化应激疗法能够改善自闭症患儿的

第22章争取自闭症的最佳疗效：治疗自闭症中或许可被逆转的情况 411

主要及相关症状，因此，值得进一步深入研究。并且，这些疗法一般被认为副作用小的安全疗法。
四氢生物蝶呤代谢
四氢生物蝶呤(BH₄)是一种自然产物，是一些关键的代谢通路中重要的辅因子，包括产生单胺类神经递质的物质、苯丙氨酸的分解、一氧化氮的产生。BH₄ 易被活性成分氧化10。研究发现，一些自闭症患儿出现某些 BH₄ 相关代谢通路或这些通路代谢产物的异常，且据报道，一些自闭症患儿脑脊液中 BH₄ 浓度有所下降。过去25年来进行的相关临床试验报道，采用沙丙蝶呤，即一种BH₄ 的合成形式，治疗自闭症患儿取得令人鼓舞的疗效[!。 3项对照研究和几项开放性研究均表明，采用沙丙蝶呤治疗自闭症患儿，能够改善其语言交流、认知能力、适应性、社交能力及言语表达能力，尤其是年龄低于5岁的儿童，以及在试验初期功能相对健全者。并且，近期一项双盲安慰剂对照研究已经证实了沙丙蝶呤应用于自闭症患儿中的疗效。Frye 等在一更新的公开标签的临床研究发现，采用沙丙蝶呤治疗有助于改善自闭症患儿氧化还原代谢异常，并从根本上改变其BH₄ 代谢。有意思的是，血清一氧化氮代谢标志物能够预测自闭症患儿对沙丙蝶呤的反应[¹²],这些结果提示，BH₄ 补充疗法可能对一氧化氮代谢具有特异性作用。

新兴疗法的常见分子机制

前文所探讨的代谢系统研究表明，一种代谢系统异常可导致另一代谢系统的异常，有时候可形成恶性循环，导致几个系统的代谢异常。相反，许多对自闭症有效的新兴疗法可以改善患者多种代谢系统功能。此处我们探讨几种新兴疗法的作用及共有功效。
可能几种代谢异常之间最熟为人知的关联是它们都有线粒体功能障碍和氧化应激反应异常。各种氧化活性分子(reactive oxygen species,ROS)水平升高可导致线粒体功能障碍3,22]。线粒体功能障碍反过来又能够产生渐进性损伤的自身循环而加剧功能缺损。例如，电子传递链复合体 I 功能障碍能够产生大量的氧化活性分子和氮化活性分子(reactivenitrogenspecies,RNS)。( 校译者注：“电子传递链”和“呼吸链”指的是同一个反应链。但由于译者在上面已用了“电子传递链”,所以从一贯性出发，在本章的所有地方都改成“电子传递链”。另外，“reactiveoxygenspecies”和“reactivenitrogen species”翻译成“活

性氧”和“活性氮”似乎不太准确，它们是两大类反应度很高的各种分子，常常不只含有氧和氮。从中文的相关文献里看，似乎翻译成“氧化活性分子”和 “氮化活性分子”会更好一些。)这些氧化和氮化活性分子反过来又能够抑制电子传递链的功能，比如抑制复合体I 的活动，这导致更多的氧化和氮化活性分子产生。(校译者注：电子传递链上有四个复合体。这里讲的是复合体 I, 也就是NADH-泛醌还原酶)大脑可能是对出现受损的线粒体功能障碍和氧化和氮化活性分子的加速生成之间的恶性循环尤为敏感的区域，因为脑中谷胱甘肽水平只有外周组织(如肝细胞)的1/50,使神经元对线粒体功能障碍导致的氧化和氮化活性分子升高尤为敏感。
有意思的是，许多新兴疗法治疗自闭症不仅能够改善其症状，同时能够缓解线粒体功能障碍和减少氧化和氮化活性分子的产生，这些疗法包括含维生素 B、抗氧化剂、维生素E 和辅酶Q10 内在的复合维生素疗法64-67]。
叶酸代谢障碍可与氧化还原和线粒体代谢互为影响，诱发疾病，尤其在大脑。叶酸是产生谷胱甘肽的必要前体，因此，熟为人知的与自闭症有关的叶酸代谢相关基因多态性可减少谷胱甘肽的产生和利用¹³]。减少的谷胱甘肽可导致对线粒体有损伤的氧化和氮化活性分子的增加，进而使氧化应激进一步增多。线粒体功能障碍可危及叶酸α转运系统，导致脑内叶酸水平降低。并且，自闭症出现氧化还原异常被认为与炎症介质因子的升高有关，提示免疫系统的激活。而这一免疫反应能够导致叶酸α受体自身抗体生成增多，进而造成通过血脑屏障的叶酸减少。就高浓度的氧化活性分子而言，需要相对高水平的叶酸以产生谷胱甘肽，因此，若叶酸α受体转运系统功能失常，叶酸水平降低，则大脑极易受损。转运至中枢神经系统的叶酸减少，使得线粒体功能障碍和氧化应激更加严重，进一步导致病情恶化。亚叶酸疗法可能尤为有效，因为亚叶酸是叶酸的一种还原形式，能够利用还原态叶酸转运器转运进入脑内，以增加脑内叶酸浓度，并在此过程中绕开叶酸基因有害多态性或叶酸α受体自身抗体所引起的代谢阻碍。
BH₄ 代谢异常可能与氧化还原异常尤为相关。 BH₄可作为抗氧剂，易被增加的活性氧/活性氮氧化。有意思的是，要循环利用氧化的BH₄, 有赖于叶酸，当氧化和氮化活性分子增加时叶酸降低。氧化BH₄ 可导致还原的蝶呤/氧化的蝶呤比率降低，而蝶呤比率对于调节一氧化氮合成酶耦合至关重要。当该比率降低时，一氧化氮合成酶无法耦合，进而产生过氧亚硝酸盐(一种氮化活性分子),而非一氧化氮，因而形成氧化程度更重的微环境。这反过来能进一步减少还原的蝶呤/氧化的蝶呤比率，使得这一异常现象更为严重。Frye10]

第22章争取自闭症的最佳疗效：治疗自闭症中或许可被逆转的情况 413

进行的生物标志物研究表明，当一氧化氮合成酶未耦合时，其反应水平上调，这可能是机体尝试着合成更多的一氧化氮。因此，当机体想合成更多的一氧化氮的努力失败时便可能产生氮化活性分子，这会进一步减少 BH₄ 的生成。有意思的是，沙丙蝶呤疗法不仅能增加可用的BH₄ 的浓度，还能从根本上改变蝶呤代谢，使得氧化的蝶呤能够显著减少。这一基本代谢改变更可能有利于一氧化氮合成酶的耦合，从而恢复一氧化氮的合成。

未来方向

本章列举了一些与自闭症相关的特殊代谢异常及其治疗方法。研究证据表明，这些代谢障碍的治疗与提高一些自闭症患儿的认知和行为能力有关。由于许多疗法仅经过初步研究，尚不明确这些特异性疗法在对其敏感的自闭症患儿中有多大效用，以及对疗法敏感的自闭症患儿所占百分比。然而，一些疗法，如亚叶酸，有望对大部分自闭症患儿有效。
前文列举出的疗法所具备的一个优势是，生理机制明确，且可用以挑选该疗法最适用的患儿的生物标志物也易获得；在这些患儿里也最易将生理改变和认知、行为能力改善联系起来。初步研究认为，上述治疗对很多生理异常的自闭症患儿可能有效。例如，线粒体功能障碍发病率从5%～80%不等[22,34,35,据估计，阻碍性叶酸α受体自身抗体发病率在47%[961~60%[81之间。显然，有待进一步研究以确定自闭症患儿中特异性代谢异常所占比例，以及某个特定的疗法会对哪一类亚群有效。已具备相应的代谢性生物标志物的一大潜在优势是，那些有导致自闭症的生理异常的患儿可在早期，甚至有可能早到尚未出现病症时就被识别，在此时干预有可能疗效最佳。
有意思的是，这些生理异常不仅适用于自闭症患儿，还广泛适用于精神性、神经发育性、神经退化性疾病。例如，线粒体功能障碍常相伴精神分裂症、抑郁症、抑郁症、躁郁症、老年痴呆症140]、帕金森综合征。因此，上述所列举的针对自闭症代谢异常的各种治疗可广泛应用于其他疾病。

本章要点

● 自闭症谱系疾病与一些代谢系统的生理异常相关，包括线粒体、氧化还原、叶酸和四氢生物蝶呤代谢异常；
●治疗这些代谢系统异常可采用安全、患者接受度高的疗法。有报道称，这些疗法中有些对于自闭症谱系疾病的主症及相关症状有良好的效果；

414    ASD 的个性化治疗和一生不同阶段的议题

●这当中有许多生理异常互为影响，一种代谢系统异常可导致其他系统异常，反之亦然。或者，适用于治疗一种生理异常的疗法可同样改善其他代谢系统异常；
● 这些生理异常具有相应的生物标志物可以帮助辨选出能从上述疗法受益的自闭症谱系障碍患儿。那些生物标志物还有可能在其出生早期，在尚未出现病症时辨选出患儿，以便及早进行干预治疗。
●许多代谢异常还与其他如精神性、神经发育性、神经性疾病的发病有关，表明这些生理异常可能是诸多疾病的最终的共同致病原因。

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第23章

经颅磁刺激在自闭症中的应用

Manuel F.Casanova,Estate M.Sokhadze
李莎莎孔健译，董存建孔学君校

摘要

重复经颅磁刺激(repetitive transcranial magnetic stimulation,rTMS)是一种可以无创地改变大脑活动模式的方法。rTMS已作为安全、没有遗留不良反应的新型治疗手段，应用于精神、神经系统多种疾患并获得普遍认可。针对于自闭症谱系障碍(autismspectrumdisorders,ASD),rTMS可望成为独特的治疗方式。最新的证据表明，ASD的症状发生可能与大脑皮层兴奋性增加有关，尤其是与增加的皮层兴奋/抑制的比率以及远程皮质连接度缺失有关。已有研究发现，大脑局部连接过度的神经网络可解释自闭症儿童在某些独立任务(例如，视觉辨别)中的超常能力；但与此同时，神经网络远程连接不足可解释自闭症的其他特征(例如，缺乏社交互动)。皮层的兴奋/抑制比率增大和高于正常的皮层“噪声”或许可以解释在自闭症个体常记录到的对听觉、触觉和视觉刺激呈现的强烈厌恶反应以及他们较高的癫痫发生率。然而，应用特定的刺激参数，rTMS已被证实可通过选择性激活皮层抑制型神经元活性而增加皮层抑制。在本章所陈述的一些研究中，我们的团队评估了rTMS对 ASD 选择性注意和执行功能指数以及其社会意识、多动、烦躁和重复/刻板行为的疗效测量。我们用脑电图(electroencephalographic,EEG)和事件相关电位(event-related potential,ERP) 的测量来评估ASD患者在rTMS治疗前后选择性注意和执行功能变化。同时，我们也使用神经心理学问卷对受试者进行 ASD症状学评估。经 rTMS 治疗后，ASD 在反映选择性注意和执行功能的EEG、ERP 测量中显示出显著改善，且激惹和重复/刻板行为的测量中亦显示出明显改善。在分别使用6周、12周和18周长疗程rTMS治疗的自闭症儿童的3个试验研究中，我们的初步结果表明rTMS有可能成为研究和治疗自闭谱系障碍的重要工具，且可能在改善ASD病患的生活质量中起重要作用。本章提出该领域未来进一步研

第23章经颅磁刺激在自闭症中的应用 425

究的方向与展望。
关键词：经颅磁刺激(TMS);自闭症；事件诱发电位(ERP); 电脑图 (EEG); 行为。

前言

重复经颅磁刺激(Repetitive    transcranial    magnetic    stimulation,rTMS)提供了一种无创性调节大脑的兴奋性的方法。 rTMS 很可能通过感应电流诱发大脑皮层的短时程功能重组，其诱导的可塑性大小及方向取决于rTMS 刺激参数 (刺激强度、刺激频率、刺激数量)和rTMS 刺激靶点皮层的功能状态。由于 rTMS的作用效应不限于刺激的皮层靶点，同时会引起解剖结构与功能联结皮层区域的功能变化，因此，rTMS作为研究分布式功能网络中的神经可塑性，不失为合适的技术1,2]。同时，rTMS·的长期效应为研究各种疾病的病理生理过程的动态变化提供了新的可能性，且很有可能治疗某些精神疾病。依据国际惯例，0.3～1.0Hz 频率范围内的rTMS 被称为低频的“慢”rTMS, 而高频的 “快”rTMS是指频率大于1Hz。Hoffman 和 Cavus 在其对低频 rTMS 研究的综述中提出了长时程抑制(long-term depression,LTD)和长时程强化(long-termpotentiation,LTP)作为理解低频rTMS 效应的作用机制³。新皮层长时程抑制和由低频rTMS诱导的皮层兴奋性的变化可随着几天里刺激数量的增加以叠加的方式累积。低频rTMS和长时程抑制的研究表明当施用数量众多的刺激脉冲数时具有对皮层兴奋改变的累积功效。逆转以前被长时程强化所增强的突触传递，即去强化作用，可能是低频rTMS作为治疗工具时最相关的理论基础。
rTMS是一种简单的门诊操作技术，每次治疗持续约20～30分钟。患者坐在舒适的躺椅上，戴着游泳帽，在游泳帽上勾画出TMS线圈放置的位置，同时确保每次治疗线圈置于同一刺激位置(图23-1)。在治疗开始之前，每个患者需首先确定“运动阈值 ”(motor       threshold,MT)。运动阈值是电脉冲在运动皮层上传递时产生可检测的运动反应的强度。将传感器连接到与刺激部位相对应支配的手肌(如拇长展肌),使用计算机辅助的生理监测工具监测运动反应。脉冲的输出以5%逐次递增，直到在肌电图(即，监视器)上观察到50μV 波幅或观察到肌肉的可见抽搐。一旦确定了患者的运动阈值，将线圈移动到目标刺激靶点(如背外侧前额皮质),并根据MT调整刺激的脉冲强度。
TMS通常被认为是安全的，即无持久的不良反应发生。已有报道的不良反应包括在刺激当天轻微的瞬时紧张型头痛和由于发放脉冲的噪音引起的轻度不适。Wasserman等1996年报道有一定的诱发癫痫发作的风险，癫痫或家

426 ASD 的个性化治疗和一生不同阶段的议题

图23-1 接受经颅磁刺激(TMS)治疗同步生理监测的患者

族癫痫史的参与者通常被排除在rTMS研究之外。
作为预防措施，一些rTMS 研究调整刺激强度低于受试者的运动阈值。 rTMS 通常被认为可安全用于儿科人群，未见报道显著的不良反应或癫痫发作。
众所周知，rTMS 已广泛应用于许多种成年人的精神和神经障碍。最新报道显示，rTMS也已用于儿童和青少年群体的相关研究。许多研究成年人和青少年抑郁症报告表明，重复额叶刺激后患者心情得以改善；亦有报道称rTMS 可改善注意缺陷多动障碍(Attention Deficit Hyperactivity Disorder,ADHD)的症状7-9]。此外，已发现rTMS可缓解与焦虑症相关的某些症状，例如创伤后应激障碍(Post-TraumaticStressDisorder,PTSD)和强迫症(Obsessive-Compulsive Dis- order,OCD) 。在帕金森病(Parkinson's    disease,PD)中，大多数研究已揭示 rTMS对临床症状的有益作用11]。目前，唯一的被美国药物食品管理局 (FDA) 批准的基于rTMS疗法的适用症是耐药性重度抑郁症；不过，很可能在

第23章经颅磁刺激在自闭症中的应用 427

未来，rTMS将被批准用于治疗其他的精神和神经性障碍。

自闭谱系障碍的抑制缺陷和 TMS 的潜在作用

新近的综述详细描述rTMS在自闭症研究和治疗的现状。针对自闭症谱系障碍(autismspectrumdisorders,ASD)的临床特点，rTMS 作为治疗方式具有独特的应用。ASD 具有社交和沟通障碍、单一和刻板行为模式，以及对环境经常产生异常反应等特征。自闭症的很多缺陷似乎可从大脑皮层兴奋与皮层抑制的比率增加、过度的局部皮层连接以及长距连接度的缺失来理解。局部连接过度的神经网络可以解释自闭症儿童在孤立任务(例如，视觉辨别)中的超常能力，同时，长距连接不足可解释该障碍的其他特征(例如，缺乏社交互动)。皮层兴奋与抑制的比率增加，高于正常皮层“噪声”可解释自闭症中频繁报道的对听觉，触觉和视觉刺激强烈的厌恶反应19]。
“微皮层柱”是大脑新皮层的基本结构和功能单位，主要由纵向分布的锥体神经细胞和围绕其树突和轴树突并调节其输入输出功能的各类γ氨基丁酸能的中间神经元组成。根据“微皮层柱”假说，自闭症与皮层细胞结构发育异常有关20,21。在自闭症患者中，微皮层柱的神经纤维网空间(即微皮层柱里的周边结构)的缩小揭示了该解剖结构的异常，这个结构(即微皮层柱的神经纤维网)是锐化微皮层柱边界及增加其分辨率的神经侧向抑制发生的地方。这种抑制作用主要源自双花束神经细胞的轴突束22-24]。在微皮层柱周围神经纤维网空间中的双花束细胞提供了围绕微柱中心的“纵向抑制”[26,27】。在微柱中的其他γ氨基丁酸(GABA) 能细胞具有沿横向延伸数百微米的侧枝，在更大的范围里对周围的微皮层柱提供侧向抑制。
每个微皮层柱的输出值彼此相对独立，其独立的程度取决于其周围神经纤维网空间里的GABA 能神经元的活动。这导致跨越微柱场的兴奋性活动振幅的梯度。Rubenstein 和 Merzenich 认为GABA能抑制活动的降低可以解释自闭症的一些症状，包括癫痫发作率增加和听觉-触觉超敏。这个假说与ASD 个体相对于正常人的新皮层中微皮层柱的外周神经纤维网空间减小的发现一致。在此模型里，神经纤维网空间减小会导致微皮层柱变小；这些变小的微皮层柱汇聚成兴奋性活动得到协调的，离散独立的微小区域。重要的是，在青春期前，约1/3的自闭症患者至少两次无诱因痫性发作。相关病例报告显示，抗癫痫药可改善癫痫患者的自闭症特征。抗癫痫药在自闭症中可能具有一些益处，但较大剂量使用可能诱发严重的副作用，包括意识丧失、甚至昏迷。这些不良反应是由于抗癫痫药的非特异性性质，其作用机制(增加 GABA能神经张力)与细胞类型无关(例如，双花束、大小篮状细胞、枝状吊灯

细胞)。抗癫痫药的效果与低频rTMS的特异性相反。本技术里的磁刺激可在与扩充或消退磁场成直角的导体里感应生电(电磁感应定律)。这个效应在尝试特异性激活环绕微皮层柱的抑制性神经元和其神经纤维时可能具有治疗作用，因为这些分布在外周神经纤维网里的解剖组分处于对大脑皮层特别有利的位置。
Ogawa等研究了低频rTMS刺激右侧大脑初级体感皮层(0.5Hz,50脉冲， 80%运动阈值强度)刺激前后躯体感觉诱发电位(somato-sensory evoked poten-tials,SEP)的高频振荡(highfrequencyoscillations,HFO)变化³7]。HFO, 其代表皮质内抑制性神经元之间的局部活性，在低频rTMS后显著增加，而SEPs 没有改变。该研究结果表明低频rTMS通过调节皮层内抑制中间神经元的活动影响皮层兴奋性，其持续效应超过刺激时间，因此rTMS可能在精神、神经类疾病具有治疗效果。该结论与我们的研究假说吻合，低频rTMS将增加微皮质柱抑制性神经元的活性，从而进一步提高增强功能辨识所需的空间衬比。
然而，rTMS是否安全适用于儿童的疑问依旧存在。 Quintana 评估了18岁以下的人群使用TMS的研究[⁵。48项研究的综述共涉及1034名儿童；35项研究使用单脉冲TMS(980 儿童),3项研究使用配对TMS(20 名儿童),7项研究使用rTMS(34 名儿童)。 TMS研究已用于检查年龄段18岁以下者中枢神经系统各神经元的成熟度和活性，并用于评估癫痫、多发性硬化、肌阵挛患者神经元可塑性、跨胼胝体抑制及运动皮层功能，尚未见癫痫发作风险的报道。重复性TMS也逐步应用于儿童精神障碍，如多动症(ADHD),多动症伴发抽动秽语(Tourette)和抑郁症。尽管在儿童中使用rTMS的研究数量有限，这些报告均未见显著的副作用或痫性发作。

自闭谱系障碍的电生理研究

与正常人相比，自闭症患者清醒态脑电图(electroencephalogram,EEG) 的频谱分析表明脑慢波活动增加，前额和颞叶区域减低的脑电活动，变异性减少，大脑半球间和半球内的脑电活动不对称性减低。在EEG 的γ频谱带 (30～80Hz,特别是40Hz 为中心的频段)的振荡活动与格式塔(Gestalt) 感知，和诸如注意，学习和记忆的认知功能有关[42。γ活动增加被广泛地与自上而下的注意过程和物体感知相联系，而且在视觉、听觉和视听刺激的延迟匹配- 样本任务中以及工作记忆任务中γ活动增多[42-50J。人类实验也已经发现诱导的γ活性与“绑定”相关5。即通过同步γ频率活动来绑定广泛分布的细胞群，这被认为是代表人脑中的外部刺激与在大脑相关区域呈现的反应一致性的生理基础S²,53】。根据此假说，EEG 中γ活动的变化已经被认为是处理格式

第23章经颅磁刺激在自闭症中的应用 429

塔模型(Gestalt-like    patterns)的指标。
有研究者提出，绑定的时间上的缺陷使得大脑里特异的局部网络整合度降低而导致了自闭症的一些症状。Brown 在一项实验中给青春期自闭症患者和年龄相仿的正常人观看了带有各种形状的视错觉图片(卡尼萨错觉图， Kanizsa Figure)或随机图片】。上述感知任务中，在刺激后约300ms(正常对照组)和刺激后约100ms(自闭症组)在大脑枕部注意区域能可靠记录了γ 活动爆发。在行为上，反应时间或准确度方面自闭症与正常对照组之间没有差异。虽然两组在卡尼萨随机图条件下显示几乎相同的活动，但是在带形状卡尼萨形状视错觉图条件下差异显著。当感知形状时，自闭症组与对照组相比有三种不同：①γ频段功率谱高于对照组；②具有自闭症的组显示提早的γ 活动爆发(80ms 至120ms);③自闭症患者中γ频谱带里出现较晚的组分比正常组更强大，且活动开始出现的时间也更早。Brown的研究表明，降低γ活动的能力缺失会导致面临多个选择时难以做出对哪个事件给予关注⁵8,因此，过度的γ活动可能与注意力集中的能力降低有关。在自闭症中，强大的、无阻碍的γ活性表明大脑中没有一个神经回路能起主导作用，太多的神经回路同时都在活跃着。根据该假设，预测 ASD受试者在刺激信息编码和记忆复述期间于额皮质和视觉处理区域显示γ活动的异常。经rTMS治疗后，执行任务无关的视错觉图像中记录到降低的γ活动，将支持低频rTMS可以降低减少γ过度激活模式的假说。
事件相关电位(event-related potentials,ERP)反映感觉皮层，感觉运动关联皮层和与高级认知加工相关的脑区神经系统的激活。系列研究表明，自闭症的儿童和青少年在ERP 中显示出异常61,62]。自闭症儿童的奇数球的测试中，与正常儿童相比，额叶-中央N100 组分的潜伏期缩短和振幅增高。与正常的儿童不同，自闭症患儿主要表现为标准奇数球任务中的P300 电位异常。 Kemner等报告视觉刺激引起的枕区P300 电位小得异常。使用简单的视觉目标检测的研究，发现患者空间视觉注意任务时，额叶的P300 电位出现延迟，枕叶的P300 电位则没有变化，因而出现两者之间的解离。以ERP 检索相关研究文献，不同的作者描述了自闭症中央听觉处理的缺陷。总体而言，自闭症中的感知过滤以全或无方式发生，通常对于外周刺激发生的位置、刺激的行为相关性，甚而对刺激的感觉形态几乎无特异性。自闭症患者的注意力似乎更多地建立在对一般性唤起的粗略控制上，而非选择性激活特定感知系统。
我们团队的研究发现，在视觉任务中过度γ振荡和 ERP反应71-74]与其他

研究一致，研究发现自闭症患者大脑中的神经系统常被异常激活。在自闭症中，由于有助于整合信息处理的认知加工的神经网络无法正常运行，导致皮层活动增加，具体表现为γ和ERP 的反应异常，即自闭症感知加工诱导的神经活动提前且持续更长时间。自闭症中降低上述皮层反应的能力减弱，可能反映皮层抑制能力的缺陷，并且可能导致自闭症患者的脑过度激活。对感觉刺激的皮层反应过大(即信号/感觉放大)可能在ASD 症状的呈现中(例如感觉高敏感性，社交互动障碍)起重要作用。在感觉特殊皮层区域(例如，枕部 EEG 位点的视觉皮层)里，靶向刺激和非靶向刺激所引起的振幅增强但分辨率不高的反应以及功能性连接的降低都支持大脑局部异常激活模式(局部过度连接与整体连接不足)。
我们假设与它们的神经投射与皮质表面无恒定的关系的其他抑制性细胞其他抑制性细胞(即，篮状细胞和枝形吊灯细胞)相反，双花束细胞的几何形状上的一致性的朝向以及位于微皮层柱的周围(环绕抑制)使其成为平行作用于皮层的脉冲磁场进行诱导的合适靶点。在治疗过程中，低频rTMS 可以恢复皮层兴奋和皮层抑制之间的平衡，这可改善长距皮层连通性。迄今为止，我们致力于自闭症临床，行为和神经影像学成像测量的研究，以验证rTMS 治疗 ASD的有效性。

我们用rTMS 来治疗自闭症的研究

我们的研究检查了低频(0.5～1Hz)rTMS 对自闭症儿童和青少年的行为，脑电图和ERP 结果的影响。将研究对象随机分配至积极治疗组或等待名单组，使用rTMS 对背外侧前额叶皮层(dorsolateralprefrontalcortex,DLPFC)进行 6周、12周或18周连续刺激。我们预测，与等待名单组相比，在认知任务中使用相同的功能测量(EEG,ERP等)的重复测试中可以检测到治疗组TMS 治疗前后变化。我们预测刺激DLPFC的低频rTMS 将通过激活抑制性GABA 能中间转接神经元导致改善的兴奋性/抑制平衡的皮质抑制的改变。
在我们的第一个研究中7,测量了8例ASD儿童和5例等待名单上的儿童参与者执行视觉注意任务时EEGγ 带，然后经过6次低频rTMS刺激前额叶皮质的治疗，重复测量EEGγ 带。该研究也使用年龄匹配的、发育正常的13 名儿童作为对照组。我们假设ASD 组由于缺乏皮层抑制而具有过量的γ带活动，经低频rTMS的治疗将有助于恢复抑制性张力(即，降低过度的γ带活动)。该研究同时分析了rTMS 治疗后与 ASD 相关的症状的临床和行为问卷调查的变化。视觉注意任务采用已被证明在视觉任务中容易产生伽玛神经振荡的卡尼萨视错觉图。

第23章经颅磁刺激在自闭症中的应用    431

我们要求受试者在看到目标卡尼萨正方形时忽略所有其他刺激，按下按钮。卡尼萨刺激由形状特征的诱导盘构成，可构成错觉轮廓(正方形，三角形) 或不构成错觉轮廓(共线特征)。我们发现在正常个体里，γ活动只在靶向视觉刺激呈现期间增加。我们也发现，与对照组相比，ASD 组的前额叶皮质γ振荡功率更高，发生更早，尤其是对非目标刺激错觉的反应(图23-2)。此外， ASD组中目标和非目标刺激之间的γ功率差异较小，特别是在额叶外侧，额叶和顶叶记录位点。经6次低频慢速rTMS刺激左前额叶皮层，γ振荡功率谱对非靶向卡尼萨数字的反应在刺激同侧的额叶和顶叶位点明显减少，同时在靶标和非靶标刺激的伽玛应答之间差异更显著。
额叶P3a 位点的电位对于非目标刺激的振幅的反应显著降低，而对目标刺激的反应没有显著变化。 rTMS 对中央-顶叶P3b 电位的振幅对非靶向刺激的反应则没有影响，其潜伏期缩短。根据临床和行为评估，ASD 组显示重复行为量表(RBS) 的显著改善，此量表用于评估与ASD 相关的重复和局限的行为模式(例如，刻板，自我伤害，强迫和局限范围)783。

rTMS调节针对靶向目标及非靶向目标而引发的γ波频(F7)

时间(ms)                                                       时间(ms)

图23-2 rTMS调节在额叶F7 位点记录的由目标和非目标的视错觉图诱发的γ振荡。经12次疗程TMS治疗之后，对非靶向目标的早期γ反应减少，而针对视错觉图像的γ振荡功率增加

在另一项由不同参与者参加的研究中，我们使用卡尼萨错觉图片研究了 1 6 例ASD(使用rTMS组)和9例年龄匹配的对照组(不使用rTMS) 的γ频段活动强度。我们评估了12次双侧低频rTMS刺激前额叶皮层对ASD患者的作用71,79,80】。在ASD个体中，γ活动强度与刺激类型无关，而在对照中，目标刺激和非目标刺激之间的早期γ频段功率谱的差异是非常显著的。经rTMS 干预之后，ASD个体在目标和非目标视觉刺激之间的早期γ频段功率谱的差异有了明显改善，rTMS治疗也显著降低了自闭症患儿的易怒性和刻板行为。
由于ERP 技术提供测量了感知和认知加工处理的神经生物学方法，我们

432    ASD 的个性化治疗和一生不同阶段的议题

也研究了ASD中的ERP 异常。在上篇文章里，我们在11例高功能自闭症儿童和青年与11例年龄匹配的正常人中研究了由3种不同的视觉选择注意刺激所诱导的ERP⁸11 。与对照相比，ASD患者对无关的视觉刺激显示出明显增强和时间延长的皮层反应；最近，这些结果在随后的一项研究中得以证实，这项研究使用了类似卡尼萨视错觉图形的任务评估了15名ASD 受试者和15名正常受试者的ERP 反应72]。我们特别感兴趣的是评估12次低频rTMS 对背外侧前额叶皮层DLPFC 刺激对 ERP 的影响(图23-3和图23-4)。我们在25 例ASD患者的研究结果显示，经双侧低频rTMS的12次治疗，病人在代表选择性注意力的ERP 指数，减少运动反应错误，以及减少重复行为和易怒上有很明显的改善。经rTMS治疗后，我们发现ERP 的 N200 和 P300 电位组分有很显著的改善，反应误差以及用临床行为问卷测定的刻板行为和易怒性也显著降低。

图23-3 低频rTMS治疗在治疗前(基线，左图),6次(中间图)和12次(右图)治疗后在前额- 中央部位记录到的由目标(实线)和非目标(虚线)视错觉图形诱发的 ERP 的变化。图中的蓝带显示了感兴趣的ERP 组分(N100,P2a和 P3a) 。图中记录的反应轨迹是18名ASD 受试者总的平均值

此外，在我们以前的一个ERP 研究中，我们通过评估错误监测和纠正，研究 1 4 例ASD 和14例年龄和IQ 匹配正常人的执行功能。有很明显的迹象表明 ASD组在错误检测、评估和校正方面出了问题，这可能是在 ASD病人中与行为和/或社交障碍相关的自我监测方面有普遍缺陷的原因。我们进而评估了12次双侧低频rTMS 疗程对误差监测和校正的影响。与随机化非 rTMS 治疗组相比，rTMS治疗组在错误检测和校正方面显示出显著的改善;该结果可作为rTMS在 ASD中提高执行功能和行为表现的证据。
在最近的研究中，我们比较了双侧DLPFC刺激，每周一次18周连续rTMS 治疗的两组自闭症儿童(TMS 治疗组，等待治疗组，每组 N=27例)的临床、行

第23章经颅磁刺激在自闭症中的应用 433

非靶向Kanizsa       靶向Kanizsa                   TMS 后对非靶向的反应降低

正常对照

6次rTMS后
刺激后410ms

自闭症基线 12次rTMS后
总平均(N=19/每组)

图23-4在正常及自闭症儿童里由目标和非目标视幻觉图像诱发的ERP(P3b,刺激后410ms)在治疗前(基线)和6次，12次rTMS 疗程后的二维脑波图谱(每组 N=19) 。TMS 治疗后顶部位点对非目标刺激的P3b 幅度降低

为和皮层电生理结果18]。TMS 治疗后评估显示异常行为检查表(AberrantBe- haviorChecklist,ABC)测定的易激惹性和多动性下降，以及重复行为量表(Re-petitive Behavior Scale,RBS-R)的刻板行为减少。在rTMS 治疗之后，我们还发现与等待治疗组相比，TMS 治疗组额叶和额叶-中央N100,N200和 P3a 的 ERP 组分对非目标刺激的反应幅度的降低及潜伏期延迟的改善(图23-5)。TMS治

额叶脑电图位点

20 F1

1Fz F2

sF2-FCZ

1F1-FCz

6 FCz

rTMS18次后

20

11

4

5

恭
5.01 μV
N=27
自闭症TMS

图23-52 7 例ASD 患儿 1 8 次rTMS 治疗的额叶-额中央区域ERP 前后比较。 TMS 治疗后额叶N100 ERP 对于标准(实线；P=0.031) 和非目标的视幻觉刺激(虚线； P=0.023)的变化是统计上显著的。治疗后两者的负向幅度都变小

434    ASD 的个性化治疗和一生不同阶段的议题

疗也导致额叶P2a 差异波的增加。这些ERP 变化以及增加的中央-顶叶和枕顶P100 和 P300(P3b)对目标刺激的反应，提示在TMS治疗后更有效地处理信息。
另一重要的发现是，在操作失误期间潜伏期的减小和与失误相关的负性变大进一步证实了错误监测和校正功能的改善。改善的信息处理功能也表现在这类以运动反应准确度形式表现出来的行为反应测量。我们的研究结果表明，rTMS改善ASD 的执行功能，表现在执行功能测试期间ERP 反应的正常化，这些改善具体表现在执行功能测试期间ERP 反应正常化，反应时间和准确性更佳以及临床行为评估的改进。

结论

总之，我们的初步结果显示TMS针对ASD的核心症状的治疗方式具有广阔的前景。低频 rTMS治疗降低过度γ活动，增进ASD 患者视觉任务引起的 ERP 反应并改善处理相关和不相关的刺激信号之间的分辨能力。目标刺激的运动反应错误百分比也显著减少，rTMS还与误差检测和校正功能指数的显著改善相关联。
此外，低频rTMS显著改善大脑不同区域之间的协调活动或一致性，并显著改善与ASD相关的重复和局限行为模式71,73,77,79]。我们的研究结果表明，低频rTMS具有潜力成为ASD 干预中的重要治疗手段，并且可能会在改善许多患者的生活质量中发挥重要作用。
TMS 是一种无创性疗法，它可以诱导局部电流，也可以调节特定的等磁场皮层区域的功能。总之，我们的研究整合起来后可提供探索性临床干预，这种首创的临床干预是基于从针对自闭症核心缺陷的神经病理学数据衍生而来证据之上的。其他干预(主要是药理学方面的)则针对自闭症的不具普遍性或不能被广泛地用到不同自闭症病人的附属症状。我们的rTMS 研究不是治疗病情连锁反应的最终结果，而是关注核心病理特征，从而有望为受影响的患者带来更好的预后。

未来方向

本章的目的并非是单一的详尽论述自闭症谱系障碍中rTMS 应用的研究现状。Olberman 等最近完成了一篇关于这一领域当前状态的综述。基于 rTMS通过神经调节的方法来治疗来治疗自闭症是一个全新的和迅速发展的领域，尚需深度理解rTMS治疗方案的诸多方面(受磁场影响的空间三维区域

第23章经颅磁刺激在自闭症中的应用 435

定位、频段功率、治疗频率等)以及自闭症的发育神经病理学的特性，以验证其临床效用和功效。
为此，我们提出如下我们认为特别有前景的研究领域：
●需要更多的信息以更好地定义ASD 的 EEG 和 ERP 典型异常。
●基于rTMS 治疗ASD 的一个未来非常重要的目标是使用双盲设计和假性 rTMS 作为对照进行随机临床试验。
●未来研究中要解决的主要问题之一是评估rTMS 疗效的持续时间(例如，效应是否在一段时间后消退?),从而强调严格的随访研究。
●有必要了解rTMS 是否可以与常规ASD 治疗实践中采用的其他常规行为和药物治疗的协同使用。
●需要更多的努力来了解基于ASD 核心症状的神经生物学机制，使用不同的神经成像神经科学技术，例如fMRI,DTI 等，以及与自闭谱系症状严重程度评估的临床量表资料。
●我们同意目前的结论，尚需更加严谨地设计对照的临床试验，以便评估 rTMS对 ASD治疗的真正潜力，获得FDA批准并获得全科医生和专科医生的接受。
随着过去几年的进步，希望将继续深入rTMS 治疗自闭症谱系障碍的研究。

本章要点

●重复经颅磁刺激(rTMS) 提供了改变大脑兴奋性的无创性治疗方法。
●基于自闭症大脑中观察到的异常皮质结构的“微皮层柱”假说提出了对 ASD神经兴奋性增加的一个合理的神经生理机制。
● 由于 ASD 可能是以皮质兴奋和抑制失衡为特征的神经系统疾病，因此 rTMS有望作为ASD的一种新型和循证治疗的模式。
●自闭症的电生理研究(EEG 和 ERP) 支持自闭症大脑局部连接过度和长距连接不足的概念。
●某些皮质细胞的位置和其形状的几何朝向使其成为适合由rTMS 诱导的靶点。
●我们使用rTMS 治疗ASD 儿童的初步研究和发表的论著表明：用rTMS 来诱导更多正常感觉刺激引起的EEG 和 ERP, 来减少ASD 的一些核心症状和改善ASD 相关行为是非常有前景的。
●未来研究的重点要放在定义ASD 中 EEG 和 ERP 异常以评估其(在治疗后)朝着正常人的反应方向的改变，优化rTMS 治疗方案，理解 ASD 核心症

436             ASD 的个性化治疗和一生不同阶段的议题

状的神经生物学机制，以及进行精心设计和严格对照的临床研究以评价 rTMS 治疗ASD 的核心症状的功效。

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第24章

音乐治疗：对自闭症谱系障碍患者的个性化干预

Petra Kern
曹瑾孔健译，孔学君校

摘要
自闭症谱系障碍(ASD) 的研究吸引了多个专业学科的关注。音乐治疗为特定人群及其家庭提供个性化干预，是自闭症治疗的前沿研究之一。近期的研究结果显示，音乐治疗干预可以有效增加幼龄ASD患儿的突出技能，并提供了具有显著性统计意义的依据，而对更广泛年龄段的患者其他技能和其他干预方式的研究正逐渐兴起。本章概述了以音乐作为干预方法的效果，以及当前音乐治疗实践状况，回顾了对 ASD患者干预结果的相关研究依据，强调了正在进行的研究和开创性工作，并为其成为一种有价值的治疗方法提供未来导向。
关键词：自闭症谱系障碍；音乐治疗；个性化干预措施；干预研究，未来发展。

前言

自闭症谱系障碍(ASD) 是一种神经发育障碍，目前在美国所有种族和社会经济群体中每88个个体中就有1个受累↓。众多专业团体、机构和个人都在探究其可能的原因以及有效的医学治疗和干预方法，以提高ASD 患者的独立生活能力和社会责任感。由于目前尚未发现治愈ASD的方法，因此确定适合每个人能力和需求的有效干预措施对于实现患者独立生活和健康的特定目标是至关重要的[2。
音乐治疗是由美国国家自闭症中心(National Autism Center)³所确定的

442    ASD 的个性化治疗和一生不同阶段的议题

22个新兴的干预方法之一，这些个性化治疗方法针对以下两个核心症状：①持续性多层面社会沟通和社会交往障碍，②局限性重复性刻板行为、兴趣或活动4]。音乐治疗是根据研究依据提出的，且在每次治疗中都包含了许多11项已确定的ASD特定循证实践内容。然而，目前对于音乐治疗干预有效性的研究仍是有限的，正在逐渐扩大。
本章重点介绍了音乐的重要性，调研了当前音乐治疗为ASD 患者提供帮助的临床实践、历史回顾，系统总结最新研究成果，并对该领域的未来发展进行了展望。许多机构为深入探讨个性化音乐治疗干预对ASD患者的益处和应用提供了资源和机会。

为什么音乐很重要

音乐根植于人类的每一种文化和历史当中。不同国家、种族、社会经济背景和年龄的人在日常生活中都对音乐有所重视和回应。婴儿会听着摇篮曲入睡，孩子们会在唱歌时起舞，青少年会通过乐队演奏来社交，成年人会在欣赏音乐会时感到愉悦。音乐可以通过多种形式让每个人享受并参与其中6。
ASD患者对音乐呈现出积极的反应。事实上，自从Kanner 在1943年首次对ASD进行记录以来，研究人员已经对患者超强的音乐记忆、反应力和才能进行了探究。最近的研究表明，一些高功能ASD 患儿与同龄人相比，对音调和音色有更高的敏感性，且在感知音乐结构、构架和情感方面有同样才能7,8]。然而，只有很小比例的ASD 患者是音乐天才⁹]。虽然处理音乐和音乐能力的神经机制和音乐疗法的干预作用相关，但患者从音乐治疗中获益却不必具有音乐天赋10]。
对于大多数人而言，音乐是生动而易懂的，这也包括ASD 患者在内。音乐在人的一生中是一个激励人们学习生活的非凡动力。音乐治疗师了解音乐的治疗效果，并且能够根据文化背景、患者本人偏好以及个人能力的反映来制定个性化的治疗方案[6,111。

对 ASD 的音乐治疗

医学专业学科
音乐治疗是一个已被普遍接受的医学专业，为ASD 患者及其家庭提供评估、干预和咨询服务，从而实现音乐治疗目标。它是用音乐来刺激，诱导和练习由患者本人、家人及治疗团队所发现的技能。为满足该病的特殊性质，每次

第24章音乐治疗：对自闭症谱系障碍患者的个性化干预 443

治疗都是高度个性化的11,12]。音乐治疗师是经过认证的专业人士，并遵守道德规范和专业的实践标准。音乐治疗是依据“残疾人教育法案”(Individ-uals with Disabilities Education Act,IDEA)提出并认可的干预方法，是ASD患者不可或缺的治疗选择之一。
音乐治疗实践
根据Kern、Rivera 、Chandler 和 Humpal 最近在美国进行的一项调查研究，音乐治疗师在其治疗的案例中所包含的ASD患者人数比十年前略多。目前，音乐治疗师主要服务于ASD的儿童和青少年，其次是婴儿和幼儿。大多数音乐治疗师在公立学校(K-12) 、家庭住宅、私人诊所或社区环境中提供服务。在学校环境中音乐治疗师主要提供小组活动，而在其他工作环境中以个人课程更为常见。然而，音乐疗法服务仍主要在隔离式而不是在融合性环境中提供。大多数音乐疗程通常每周提供一次，每次持续30分钟，平均以1～3年为一个治疗周期。音乐治疗师通常是一个跨学科团队的一个成员，与家长、教师、语言师、职能治疗师以及其他人协作完成治疗的计划和实施。
治疗过程
调查研究进一步表明，大多数音乐治疗师对患者当前的功能水平进行评估以确定干预计划，同时监测其病程以确定治疗类型和强度⁵]。目前很少有音乐治疗师参与筛查和诊断评估过程。由于尚没有专用于验证ASD 音乐治疗效果的评估工具，音乐治疗师使用自创的评估工具，和音乐治疗或工作空间的专用评估工具。只有少数几个经过验证的ASD特异性评估工具在其临床实践中被使用。在对ASD患者制定音乐治疗干预时，所针对的前三个问题是沟通技巧、社交技能和情感技能。接受音乐治疗的患者通常在4～6个月内达到个性化的治疗目标。基于实证实践，大多数音乐治疗师在对自闭症患者进行治疗时将行为学方法应用到音乐治疗中。用于实现治疗目标的音乐治疗方式有歌唱和练习发声、乐器演奏、运动和舞蹈、自由和主题即兴创作、作词和作曲、听现场音乐/预录音乐，以及将音乐与媒体相结合。大多数音乐治疗师在每次治疗之后记录患者的进展并记载在定期总结报告中。

音乐治疗干预的研究

基于过去：案例报告和叙事性文献综述
音乐治疗具有向全世界ASD患者提供个性化干预的悠久历史。在20世

444    ASD 的个性化治疗和一生不同阶段的议题

纪60年代和70年代，来自美国16、阿根廷17和英国18的音乐疗法先验者在许多案例报告中描述了使用音乐来提高ASD 主要技能的积极作用。在早期，前人已有报道称ASD 儿童具有超常的音乐才能和对音乐的兴趣，以及使用 “儿童为主导”方法来获得更好效果的重要性。
Reschke-Hern 的历史性回顾阐述了1940—2009年对 ASD儿童的音乐治疗研究和治疗的发展191。这篇综合性论文使我们更深入地认识到，自闭症诊断、公共法律、组织发展的改变或研究和教育的转变是如何随着时间影响 ASD 儿童的音乐疗法研究和干预方法的导向。其中一个变化是“循证临床实践”的改变，指导建立严格的科研质量指标，并确立不同层次的循证临床标准。因此，许多以前的研究不符合当下的科学标准，尽管许多研究报告已经表明音乐疗法干预对增加沟通、社会化以及减少 ASD患者的问题行为有积极的影响。Accordino,Comer,Heller²0],Simpson 和 Keen²¹ 详实的叙述性综述囊括了对ASD患者进行音乐干预的最新文献，但其对ASD 患者音乐治疗干预的实证支持有限。因此，提高干预研究的科学严谨性以及收集更多证据，以支持音乐治疗干预对这一人群的积极影响仍然是该学科的一个重点的目标。
从数据中学习：三篇系统综述

现有的研究文献检索发现三个系统综述是针对音乐方法干预幼儿到青春期的ASD患者的。虽然系统综述受到符合研究标准的文献可用性的限制，研究人员报道了效应值由小至大的疗效。总体而言，所有的系统综述都显示了疗效和前瞻性研究的阳性结果。
在Whipple²³进行的的荟萃(Meta) 分析中，确定了29项干预研究中的9 项，总共76名2～21岁的儿童和青少年作为受试者，通过分析12个因变量 (通过认知能力、沟通和社会行为进行分类),对使用音乐与非音乐的方法进行比较。由于当时有限的文献库，这个系统评价已包括的7个被评估的研究是未发表的硕士论文或博士论文；而且研究中50%的实施干预者不是音乐治疗师——这些因素如今都受到质疑。然而，结果表明无论患者的年龄、寻求的结果、音乐干预者的方法、理论方法或干预类型，所有基于音乐的干预措施都是有效的(总体影响大小d=0.77;P<0.001) 。研究者总结称，“所有的疗效都是阳性结果的，这表明了在干预中使用音乐的益处”[23】。
Gold、Wigram和 Elefant22 的 Cochrane 评价指出，在52项评估和干预研究中，只有3项小规模的随机对照试验/对照临床试验，总共24名受试者符合研究纳人标准，对2～9岁的ASD儿童进行音乐治疗干预与“安慰剂”治疗、不治疗或标准护理的比较。与以前的系统评价一样，Cochrane 报告中包含的三项

第24章音乐治疗：对自闭症谱系障碍患者的个性化干预 445

研究中有一项是未发表的硕士论文；纳入标准似乎侧重于当时不容易获得的随机对照试验；且对照临床试验的纳入标准的应用似乎有重大缺陷——更多的细节表明Cochrane评价需要更新。然而，结果指出与非音乐治疗情况相比，音乐治疗干预对增加用手势交流的技能(SMD 0.50;中等效应量)和言语交流能力(SMD 0.36;中小效应量)有显著影响，但没有减少ASD 儿童的行为问题 (SMD-0.24; 小效应量)。由于短暂音乐治疗干预(即每天1次，疗程为期1 周)的短期效应，这些研究限制了对ASD 儿童的临床应用。然而，作者总结道，“……研究结果表明，音乐治疗可以帮助自闭症谱系障碍儿童改善他们的沟通技能”。
Whipple₁0 近期进行的荟萃分析确定了8项干预研究，总共91名年龄在5 岁或以下的ASD患者，以音乐作为独立变量并与无音乐情况相比，由经过认证的音乐治疗师提供治疗，充分报告定量结果，并发表在同行评议的期刊。基于来自NAC³的科学价值评分(Scientific Merit Rating)和 Reichow、Volkmar 和 Cicchetti
向前推进：新兴研究和倡议
研究人员继续研究音乐治疗干预对ASD患者的有效性。最近的研究包括更宽泛的年龄范围(3～21 岁),并且应用更大样本量和更严格的研究设计。通过解决沟通、社会技能、联合注意力、听觉处理、感觉运动技能及以家庭为中心的模型等，其主题超越了先前的研究。
例如，Kalas 研究了简单与复杂音乐对30名ASD(4～6岁)儿童的联合注意的影响[25。所有儿童在3个星期内参加了3个简单和3个复杂的单独音乐治疗，每次进行10分钟。结果表明，清晰且可预测模式的音乐在引起对严重 ASD的儿童的联合注意的反应中更有效，而更复杂可变的音乐对于具有轻度/ 中度ASD的儿童更有效。
Schwartzberg和 Silverman²6 采用随机对照试验来探究基于音乐的社会故事对30名ASD患者(9～21岁)的理解能力和泛化能力的影响。所有受试者

446             ASD 的个性化治疗和一生不同阶段的议题

图24- 1音乐治疗干预的研究示例(Kern       &Aldridge,2006)。注：Whipple(2012)    提出的以上8项研究符合 NAC(2009) 标准，ASD 儿童治疗的4个目标领域包括 Finnigan    &Starr³0〕;Kern    &Aldridge³;Kern,Wakeford    &Aldridge³2;Kern,Wolery       & Aldridge³3〕;Kim,Wigram       &Gold³4;Lim³5;Lim          &Draper³⁶以及Wimpory37]

在一周夏令营中参加3个实验音乐治疗组或非音乐对照组中的一个。虽然结果表明两组在治疗后差异不具有统计学意义，但工作人员的个例报告提示使用基于音乐的社会故事激发和支持社交技能的学习。
Thompson研究了家庭音乐治疗模型对23名ASD(3～6 岁)儿童的社会参与的影响，对为期16周的家庭音乐治疗计划加入标准护理(治疗组)和标准护理(对照组)进行了比较。结果表明，音乐治疗期间儿童的参与程度(P< 0.001)以及家庭环境和社区的社交互动的(P<0.001) 有显著改善。此外，定性数据表明了亲子关系有所改善。
其他一些随机对照的干预研究(如网站和会议项目中所述)正在进行中：
①音乐治疗对社会技能的影响。
目前尚不清楚最近同行评议和即将出版的研究是否符合科学成绩评定 (Scientific Merit Rating)³,基于证据的实践评分(Evidenced Based Practice Rating)²4]或系统评价的未来研究纳入标准的规范。然而，从一些个人和组织提出的倡议很容易看出，音乐治疗需要改善其科学价值并达到循证实践水平。

第24章音乐治疗：对自闭症谱系障碍患者的个性化干预    447

2008年，AMTA 成立了音乐治疗和自闭症工作组/智囊团(现称为AMTA 音乐治疗和ASD 的优先战略，AMTA Strategic Priority on Music Therapy and ASD)。这些音乐治疗专家正在制定治疗策略，以提高对ASD患者对音乐治疗服务的意识和认可，增强研究和临床实践，为ASD的音乐治疗师提供进阶培训，并进行信息传播。因此，AMTA 是 National Autism Network的特别提供者，它已发布与 Autism Speaks 和 Autism Society of America 合作的信息。表24-1 列出了 AMTA 领导人倡议和提供音乐疗法服务的个人资源选择。
表24-1 音乐治疗与ASD的相关资料

资料

事实情况说明书
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书目
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博客
●MTResearchBlog:BringingCurrentResearchtoMusicTherapyClinicianshttp:// www.musictherapyresearchblog.com/category/develop/autism/MT研究博客：把现在的研究带给音乐治疗师
● FAQs:Autism.com:A Resource for Practical Ideas http://faqautism.com/

对未来研究和发展的展望

考虑到音乐治疗与ASD 密切相关的现有干预研究领域的飞速发展，研究人员将需要及时关注相关领域进展并将继续面对极其特殊的患者群体进行个性化干预的科研挑战。尽管具备充足的样本量、科学严谨性、相关领域的资料完备，但是对于这类人群治疗的推广和持续开展已经被质疑了很长时间，一些作者为改善文献中的现有缺点提供了切实的建议10,19-21,23]。这些建议在以下段落中被在一定程度上反映并补充了，可在不久的将来为研究和实践标准提供信息。
样本量和科学严谨性
尽管有趋势更多的实验性单案例和小组设计(比较音乐疗法干预组与无音乐组)不断在发表，研究人员需继续增加样本量和科学严谨性。与国家自闭症中心(NationalAutismCenters)和自闭症网络(Autism Networks)合作精心策划多站点研究可能有助于获得更大的样本量。诸如单案例实验设计的声音研究可以解释音乐治疗干预的微妙差异，而分组实验设计将允许通过统计学分析检验音乐治疗干预期间ASD患者获得的任何显著性的改善。这两种研究设计需考虑循证实践状态。
为了提高科学严谨性，研究人员会注重①受试者的明确标准纳入，如更严格的年龄范围和初步诊断(相对于多种疾病)以及②详细的研究报告，说明所有原发和继发质量指标，(特别是实验控制、可靠心理测量工具的使用、音乐治疗干预方案、保真度评级，以及推广和维护)。到目前为止，仍缺乏强劲的支持其增进的技能应用到其他生活情况的泛化以及音乐治疗干预对ASD患者的长期疗效的维持的资料。研究人员可能需要观察音乐治疗之外的变化，并在常规治疗结束后完成长期随访研究。然而，在更长的时间内寻找资金支持以及维持受试对象的获得可能是未来几年中的持续挑战。
目标领域和干预方面
已有强有力的证据支持使用音乐治疗来增加 NAC 标准报告(NAC's    Standards Report)³(即沟通能力、人际关系、个人责任和游戏技能——适用于 5岁以下儿童)中所列的14个治疗目标中的4个。然而，需要更多的实证研究来确认音乐治疗干预的积极影响：①提高学术能力、更高的认知功能、学习准备、运动技能、就业技能和自我调节，以及②减少ASD的一般症状、问题行为、限制性重复的非功能性行为模式，以及感觉或情绪调节。如最近公布的调查

第24章音乐治疗：对自闭症谱系障碍患者的个性化干预 449
研究所指出的5,音乐治疗师已经在日常实践中得到了许多其他方面的成果；今后需要对这些方面进行更多的科学的关注，以确保其有效性得到承认。
此外，研究人员应探索音乐治疗技术(如唱歌和发声、乐器演奏、运动和舞蹈)或音乐治疗方法(如行为音乐疗法、Nordoff-Robbins 音乐疗法、神经音乐疗法)以使ASD患者获得治疗效果，并充分地记录在文献中。干预的强度(如剂量)是值得思考的另一个研究主题。由于重复性对于确保在该群体的学习至关重要，因此尚不确定大多数音乐治疗师5采用每周30分钟的治疗是否足以实现期望的治疗结果。尽管如此，鉴于其经常受到各种不可预测因素的影响，进行支持日常实践的有效性和治疗价值的连贯研究可能仍然是一个挑战。
干预和学科合作的历史与现状
虽然大多数音乐治疗师在多种环境(如学校、家庭)提供干预治疗，但对环境影响和融合形式的研究很少。美国公法94-142规定了对于ASD患者的融合纳入和技能推广的自然环境。音乐治疗师和研究人员将需要检验有效的纳入实践和支持超越传统的设置和治疗模式。需要重新思考以前的理论、方法和规范，以确保接近、参与以及支持ASD患者、家庭和合作者。
服务于ASD患者的音乐治疗师最有可能是跨学科治疗团队的一员。与其他学科(如教师、语言师、职能治疗师)的合作以及包括基于音乐的其他介入干预的效果需要更多的评估。直接音乐治疗干预措施还是提供咨询服务的成本-效益将是个问题，需要进行评估。到目前为止，对 ASD患者的音乐治疗服务主要由个人支付、特殊教育计划、州/国家基金和补贴资助⁵。音乐治疗干预的未来资助可能继续是治疗师和家长对 ASD患者主要关注的问题，尽管当音乐治疗经周密的研究验证而被认可和随手可得时，获得资金可能就不是一个问题了。
从研究走向实践
音乐治疗研究的最终目的是使接受干预治疗的ASD 患者受益。因此，研究转化为临床实践至关重要。首先，这需要通过各种形式(如研究综合点、展示日常应用的案例情况介绍或音乐治疗和ASD 的网站)广泛地传播知识(比如向音乐治疗对象、治疗师和公众)。其次，应提供技能的进阶培训(如在线课程、研讨会、网络会议),这对音乐治疗师对ASD患者的治疗至关重要。最后，需要一个系统来指导治疗师实施循证实践(如导师培训、同伴辅导或反馈性咨询)和现场监测干预的场景(如列出清单、自我反思)。可持续的、基于结果的专业发展可能有助于从研究走向实践，为ASD患者提供优化的有效治疗。
目前，接受与音乐治疗相关的基于研究的认识对于治疗师和公众是具有

450    ASD 的个性化治疗和一生不同阶段的议题

挑战性的。与音乐治疗和ASD 相关的职业发展机会也很少，更缺乏对实施指导和监测的技术支持。然而，应该指出的是与其他健康领域相比，音乐治疗的范围很小，因此，与其他拥有更多成员的学科相比，传播知识、专业发展以及对治疗师的系统支持可能需要更长的时间才能实现。

结论

ASD 发病率的增加需要立即引起注意并帮助支持患者及其家庭应对这种神经发育障碍。
ASD 至今还没有一个确定的原因或治愈方法；因此，研究最适合 ASD 特质的新型治疗方式是值得称道的。音乐治疗是一种新兴的实践，提供基于每个患者独特能力和需求的个性化干预。鉴于大多数ASD 患者对音乐有积极回应，音乐治疗可以作为一种刺激激发并实践个人独立生活和社会责任所必需的技能。未来的研究将更加深入探索音乐治疗干预的有效性；其成果将帮助患者、其家庭和专业人士对于如何最好地满足该群体的需求而做出更明智的决策。

本章要点

● 自闭症谱系障碍(ASD) 发病率的增加亟需最适合每个人的兴趣、能力和需求的有效的干预措施。
●音乐深受许多ASD 患者的喜爱，它可以作为一种刺激激发和实践独立生活和社会生活所必需的技能。
●音乐治疗是一个已建立的医学专业，为ASD 患者及其家庭提供循证和个性化干预。
●自20世纪60年代末以来，许多个案报告描述了个性化音乐治疗干预对世界各地ASD患者的积极影响。
●两项系统综述报告了轻度到中度的治疗效果，而最近的荟萃分析显示，对 ASD儿童的音乐治疗干预能够在增加沟通、人际技能、个人责任和游戏能力诸方面产生中等至明显疗效。
● 对ASD 患者的音乐治疗干预作用的新兴研究正在采用更严格的研究设计和更大的样本量以满足当下的科学标准。
●探索音乐治疗干预效果的研究人员需要继续加强科学严谨性，研究其他目标领域和干预方法的特异性，并将研究内容扩展到环境背景和专业合作中。

第24章音乐治疗：对自闭症谱系障碍患者的个性化干预 451

●应当更有效地传播现有的和未来的研究成果，应提供进阶性的专业发展机会，同时应考虑实施循证实践以系统性指导和监督实践者。
●在音乐治疗领域内外进行更多的研究，将使ASD 患者更容易获得个性化的音乐治疗干预。

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第25章

美术治疗在自闭症谱系障碍患者治疗、评估及研究中的作用

Donna Betts,Rebecca Harmer,Gabriela Schmulevich 曹瑾孔健译，孔学君校

摘要
本章阐述了美术治疗对自闭症谱系障碍患者在治疗、评估和研究的贡献。美术治疗的概述向读者介绍了其应用及益处，包括其在治疗、评估和研究方面对自闭症知识库的贡献。描述了美术治疗在治疗环境(如学校)中改善自闭症症状的方法，并呈现了美术治疗对家庭成员和看护者的应用。对将美术治疗用作评估自闭症症状的实用方法进行了讨论，且以实例对面孔刺激评估(Face Stimulus Assessment)进行了描述。最后，展望了美术治疗和自闭症的最新研究和广阔前景，重点关注神经科学与美术治疗具有前景的交集。
关键词：美术治疗；自闭症；神经科学；评估；美术治疗的研究；面孔刺激评估。

前言

所有的自闭症患者都可以得益于学习如何以创造性的动手方式表达他们的想法、感觉和兴趣，不论是缓解焦虑及加强沟通，或只是展现他们富有想象力和创造力的潜能1。
本章呈现了美术治疗的概述，包括其在治疗、评价和研究方面对自闭症知识库础的贡献。探讨了美术治疗干预自闭症研究的现状，重点是新兴及扩展的研究领域，比如神经科学。

美术治疗

对于那些不熟悉美术治疗的人来讲，它被美国美术治疗学会(American

第25章美术治疗在自闭症谱系障碍患者治疗、评估及研究中的作用    455

Art Therapy Association)广义地定义如下：
美术治疗是一个心理健康专业，患者在美术治疗师的协助下通过使用绘画媒介、创作过程及得到的美术作品以探求自身感受、调和情感冲突、培养自我意识、管理行为及成瘾、发展社交技能、改善现实取向、减少焦虑、增强自尊。美术治疗的目标是改善或恢复患者的功能和他(或她)的个人幸福感。美术治疗实践需要视觉艺术(绘图、绘画、雕塑及其他艺术形式)的知识和创作过程，以及人类发展、心理及咨询的理论和技术。
美术治疗是由专业水平、经过认证的美术治疗师在多种临床和社区环境中对患者、配偶、家庭和团体等不同群体实施的治疗方法³。

美术治疗与自闭症

约有25%的美术治疗师参与自闭症患者的治疗工作4]。此外，自闭症被确定为美术治疗领域的首要研究重点[5。取决于环境的不同，美术治疗可以作为自闭症患者的主要或辅助干预方法。任何年龄的自闭症患者都可以在私人诊所、基于社区的项目和一些医院接受美术治疗，而对儿童及青少年的治疗服务通常在学校提供。
在学校进行的美术治疗针对自闭症儿童特定的几个目标。这些目标涉及生理和社会心理发展的4个方面：①认知发展，针对思想、灵活性、参与/聚焦、沟通及感觉整合的表达；②情绪调节，其目标是针对挫折容忍度/延迟满足的能力、自我监测/评定、控制、幻想与现实、升华、自我发展、自我形象、表达和情绪的宣泄释放；③适应性行为方式，其涉及独立性、成熟性、社会化、积极的同伴互动、群体认同、动机、主动性和责任感的客观领域；以及④生理发育，其目标是以身形为基础的/从部分到整体的，具有方向性、序列性，精细运动协调。
自闭症患者经历的各种症状使其具有非常独特的表现，因此其治疗必须针对各种不同需求而量身定制1,6。尤为重要的是为其提供一个安全、可预测且稳定的环境。由此，美术治疗师可以建立心理连续性的、稳定可控的环境。 Martin⁷探讨了治疗ASD 所面临的困难，并描述了美术治疗对这个群体的优势。Martin 认为美术治疗师应该是治疗团队的重要组成部分。她还指出美术治疗提供了一个空间，自闭症患者可以发展技能、实现成长，并通过视觉处理复杂的问题，同时享受创造性过程。
在试图确定治疗的功效时，自闭症的“谱”性质带来了挑战。由于ASD患者具有不同严重程度的症状，故其对治疗的个体反应是不同的。同样地，尽管自闭症被认为是在儿童时期出现的终身状态，但对青春期和成年期自闭症的核心表现的研究甚少。通过对青少年及成年自闭症患者症状的研究，Seltzer⁸

456                ASD 的个性化治疗和一生不同阶段的议题

等人试图确定自闭症诊断的稳定性以及症状严重程度随时间的变化。他们的研究对象是405名年龄在10～53岁的自闭症患者。研究发现，虽然所有受试者在儿童早期符合ASD 的标准，却只有约一半(54.8%)的受试者符合ASD 标准“使用当前评分进行诊断”(第22章)。此外，由于症状的表现会随着时间而改变，这就更加难以为自闭症患者确定最行之有效的治疗方法。
虽然目前已经进行了关于不同治疗和干预方法的研究，但研究人员仍无法以标准化的方式来评估其治疗效果。以下文献资料反映了对自闭症治疗方法的研究，以说明需要更多评定治疗功效的方法。

美术治疗的干预与自闭症

已有几位作者对相关主题进行了阐述。推荐的书目包括 Evans 和Dubowski[⁶ 以及Martin⁷ 的作品。虽然自闭症患者可能具有共同的普遍表现，但是这些表现的触发因素和原因却因个体而存在很大差异。因此，为更有效地针对自闭症患者的个人特定症状，提供更多关于治疗功效的信息是十分必要的⁹。本节讨论的主题是美术治疗的干预方式。
Bowker、D'Angelo 、Hicks和 Wells研究了家长对治疗方式的选择以及家长对治疗反应的看法。通过在线调查，970名ASD患儿的家长报告了他们目前接受的治疗、停用的治疗以及停用的原因。研究结果表明，家长可能同时对自闭症患儿使用了多种循证和非循证的治疗，此结果支持了Goin-Kochel、 Myers和Mackintosh的早期发现!。这项研究还补充了家长对治疗结果的相关看法，即家长称他们的孩子通过治疗最可能实现行为的改善，而不太可能有社交方面的改善。
在一项类似的关于父母经验与自闭症治疗的研究中，Green¹²]随访了19 位患儿家长，其采用了三种治疗方式，包括应用行为分析(ABA) 、感觉整合治疗(AIT) 以及维生素B₆ 和镁的组合。研究发现，大多数父母是从互联网、其他患儿家长或专业治疗师那里接收到了相关治疗信息。此外，研究表明实施的便利性、需投入时间和对有效性的认知是家长决定使用某些治疗方法的因素，无论是不是缺乏实证支持。但由于这项研究的样本量相当小并且为家长以自愿方式参加，故对结果进行解读时应尤为慎重。然而，这项研究有助于解读家长为自闭症患儿选择治疗方式的决策过程。 Bowker等人的研究发现，一些非循证治疗被经常用于自闭症的干预，家长通过多种渠道获得相关信息，而其中一些并未经过正规可靠的验证。因此，让家长和自闭症患者获取不同治疗方式的更多疗效信息是很有必要的。
文献中讨论了美术创作的主题及其对自闭症症状产生的益处。例如，

第25章美术治疗在自闭症谱系障碍患者治疗、评估及研究中的作用    457

Weed1³ 从艺术教育的角度探讨了美术对于ASD儿童的作用。 Weed 对 3 名自闭症男孩进行了研究分析，并报告称其在治疗期间有感知的改善和创造力的增进。发现艺术在这些男孩的生活中发挥了重要且有益的作用，具体来说，美术可能有助于ASD患者激发创造力和创新性思维的过程。
Elkis-Abuhoff14通过一项研究探索了美术治疗对患有阿斯伯格综合征 (Asperger's syndrome)的女性青少年个体的有效性。当她在治疗方案中增加了美术治疗后，发现这些青少年在沟通和社会化方面有所改善和成长。
Elkis-Abuhoff 通过量表的报告和评分提供了受试者的广泛背景信息，如成人韦氏智力量表Ⅲ “Wechsler Adult Intelligence Scale(WAIS-III)”。其在为期7个月的治疗中创建了9个项目，包括拼贴画、模板设计、蜡笔对话片段、咖啡过滤器设计、镜砖项目和面具。这个案例研究对ASD 患者美术作品以及美术治疗的益处进行了深入探索。
由 Emery²03提出的另一个案例研究关注的是美术治疗对6岁自闭症男孩的作用和重要性。美术治疗的作用和重要性通过其感知发展、成长及与他人联系的能力来衡量。Emery 发现美术治疗在物体恒定性的发展中发挥了关键作用。美术治疗在该男孩的自我发现过程中，以及在扩大他对环境的意识方面也发挥了重要作用。Emery 还对家庭参与自闭症儿童的人际关系和觉察能力的发展这个重要主题进行了讨论。家庭的作用将在本章后续讨论。
Brancheau²1 报道了美术治疗对高中学生Marshall的益处。通过创作蔓荼罗(mandalas)——患者可以用美术材料绘出并装饰圆圈——Marshall学会了减少焦虑，并自称有注意力增强的感觉。在两年的美术治疗过程中， Marshall同时表现出其社交互动、沟通能力、内控力和自我认同方面得到了改善。
在Lu、Peterson、Lacroix 和 Rousseau22 从事的一项研究中，讨论了使用沙盘游戏激发创造力。作者对沙盘游戏能否激发ASD患儿的创造力和象征性玩游戏能力进行了探讨。该研究探讨了两个主要的问题：①沙盘游戏如何以半结构化的创造性干预方式，提高自闭症谱系障碍儿童在沟通、社会化和象征性阐释方面的技能发展?②不同严重程度的ASD患儿对沙盘游戏干预的响应如何?该研究进行了10周，样本来自加拿大蒙特利尔一所学校的四个不同的特殊教育教室。Lu 等人的研究发现，接受了沙盘游戏治疗的孩子表现出言语表达的增加、更好的社会交往能力，以及新奇的象征性游戏能力的增加。其表明创造性干预可以作为ASD 儿童行为和社交干预模式的补充。通过这项研究还

观察到了有助于激发ASD 儿童创造力和象征性思维的材料和方法，以及其对自闭症患者的作用。

美术治疗校本课程

至少有3篇文章被推荐作为美术治疗校本课程示范的资料，为自闭症儿童和青少年提供帮助。
Isis、Bush、Siegel和 Ventura23 对佛罗里达州迈阿密市Dade 县的一个成功的项目进行了描述；Lister、Tanguay、Snow 和 D'Amico²4为加拿大蒙特利尔的发育障碍人群创建了一个创意美术治疗中心；此外，另一个创意美术治疗项目在新泽西洲新泽西市的公立学校，由美术治疗师Cindy Lou Nelson负责实施25。
该项目在英国也得到了落实。2003年，Osborne26 在 Berkshire,UK 测试了美术治疗对 ASD 儿童的适宜性，并讨论了美术治疗在学校系统中不是很普遍的原因。Osborne 认为，美术治疗通过非语言手段提供了教师和学生之间的共同点，并提供了一种视觉交流的机制。尽管它是很有益的，但英国学校系统美术治疗面临一些困难包括资金、资源以及建立治疗空间的能力有限。最近，Takeda27 报道称美术疗法在英国教育机构中取得了巨大的进步。这一趋势归因于英国卫生部在2004年采用全国服务架构“National Service Frame- works(NSF)”,从而英国学校提供的治疗服务有所增加。
Epp²8的一项研究在美国康州Ridgefield 进行了社交技能项目超级儿童 “SuperKids”的测试，该项目使用美术治疗和小组治疗对11～18岁的自闭症儿童进行干预。美术治疗是将自闭症患者置于一种融洽和谐的环境，在一名具有专业资格的美术治疗师的帮助下对其视觉思维进行探索。 Epp 使用分发给患儿家长和教师的量表分别在治疗前和治疗后进行测量。
据该研究称，涉及小组干预和美术治疗的超级儿童项目通过社交能力打分系统“SocialSkillsRatingSystem(SSRS)”的评测显示出患儿问题行为的改善。这虽然提供了支持美术治疗有效性的合理证据，但仍有一些局限性值得注意。受试者因方便性均来自一个上层中产阶级社区，并且样本量相对较小28]。此外，还包括治疗项目的复杂性。复杂性使得难以准确地认定哪些治疗或什么组合的治疗方式能够引起儿童感知行为的改变。但尽管如此，该研究结果仍提供了一些促进生长益处的支持，并为ASD 患者引入了创新性的治疗方式。

家庭美术治疗与自闭症

家庭美术治疗对自闭症谱系障碍儿童及其家庭是有效的。一些作者

第25章美术治疗在自闭症谱系障碍患者治疗、评估及研究中的作用 459 调查了 ASD 对家庭的影响,以及家庭美术治疗对自闭症患者的作用37-41]。
虽然ASD影响患有该障碍的个体，但家庭中的其他人通常也会受到直接的影响。Norton 和 Drew34]提出了可能由抚养 ASD 儿童而引起的家庭压力因素，例如沟通、不可预测的行为、难以变化和债务等相关的问题。Shiec- hel³6 通过荟萃分析，探索了在治疗ASD患儿的家庭时应考虑的影响因素。 Shiechel 发现育有残疾小孩和没有残疾小孩的父母的心理病理水平是不同的。此外，Shiechel 还总结称，患儿的兄弟姐妹亦受到障碍或认知缺陷的显著影响。
由于先前讨论的潜在应激源的普遍性质已经表明了一些家庭产生的适应性及应对机制。Altiere 和 Kluge³¹ 通过测试变量，如适应性、凝聚力和家庭内部相互支持，探究了自闭症儿童家长的功能状态和应对行为。其广泛的文献综述表明，沉浸式风格最适合ASD 患儿的家庭。他们研究发现，随着凝聚力水平的增加，家庭单元使用的积极应对机制会有所增加。这表明，如凝聚力和家庭动力学的美术治疗干预，可能对直接受到ASD 影响的家庭具有重要的干预作用。
据其对以往和现在的文献进行综述，Hillman33 指出对ASD 患儿及其家庭进行的研究是很不够的。Hillman 称，心理学家在治疗受ASD 影响的家庭方面发挥了重要作用，因为他们能够提供治疗方面信息、帮助克服障碍、并为家庭成员提供帮助。Osbourn 和Scott³5阐述了关于ASD 患者的诊断、治疗和对于其行为健康作用方面的信息。他们提出早期干预、家庭的帮助和总体行为健康在自闭症儿童的治疗计划中非常重要。
Gabriels₃8观察到美术治疗对自闭症患者及其家庭成员有显著可观的益处。美术治疗可以为自闭症儿童提供建立基本技能、认知技能和社会交际技能的平台。此外，多家庭美术治疗小组为经历类似的多家庭成员提供帮助和应对策略。Gabriels 探讨了家庭美术治疗的多个案例，并建议引入如家族徽章和包含熟悉的物件和家族肖像的艺术品作为指导。
正如前面提到的研究所指出的，收集治疗功效数据的主要方法是通过对自闭症患者家长和临床医生进行调查和随访。然而，父母对治疗反应的感知和体会可能无法准确地反映自闭症患者的实际体验或对治疗的感受。尤其是，自闭症患者常常有沟通的困难[421;因此他们可能无法完全用语言表达他们对于治疗经历的感受。
美术治疗评定或许能为这个问题提供解决方案，可以作为ASD 患者对于他们的治疗感受的一种替代性沟通形式。下面将深入探讨这个问题。

460 ASD 的个性化治疗和一生不同阶段的议题

美术治疗评定与自闭症

当需要美术治疗师为自闭症儿童制定IEP 目标或为自闭症成人制定治疗目标时，标准化的美术治疗评定已被证明是一个有用的工具。
它可以有助于：①确认患者对他(或她)自己和周边环境的看法，②确定患者的长处，③促进治疗团队成员之间对于患者的认识和沟通，④确认患者是否有意愿并且做好了接受美术治疗的准备，⑤确定疗程，和/或⑥准备治疗总结。
面孔刺激评估(The Face Stimulus Assessment,FSA)[43是专门为上述目的而开发的工具。诸如FSA 的工具为临床医生提供了将患者与正常人的美术作品进行比较的标准化方法，并且作为比较患者自己先前作品的基准，从而帮助确定治疗进程。在FSA的发展探讨之后，将通过一些例子来说明。
面孔刺激评估(The Face Stimulus Assessment,FSA)[43 是用于患病儿童和青少年，特别是对非语言性患者的美术评定。用于FSA的材料包括：8只油画棒的标准包；8只多元油画棒；刺激图片#1(描绘完整面孔刺激的8.5in×1lin 的 FSA模板1的打印件);刺激图片#2(描绘脸和颈部轮廓的8.5in×1lin的 FSA模板2的打印件);刺激图片#3(选项：一张8.5in×1lin的白纸)。(注：受版权保护的电子版FSA 模板和FSA 标准化操作程序的完整说明可从本章第一作者处获得)。
Betts4³ 在 FSA中使用面孔作为刺激的原因是基于Alley⁴ 对面部感知的社会及应用方面的探索。具体来说，从婴儿期开始人类面孔就能吸引我们的注意力。此外，面部被认为是与情感表达和个人认知密切相关的原发部位。 Betts的文章提出了6个案例来支持 FSA的发展应用。 Hamilton45 通过与Betts合作建立了基于美术评估的评级系统而进一步推进了FSA 的发展。在Hamilton的研究中，对30名本科生进行了FSA, 并使用美术治疗正规成分量表(Formal Elements Art Therapy Scale:the Rating Manual,FEATS)中的9个适应性量表对其进行评分。具有统计学意义的结果表明，该评分系统对正常成年人绘制FSA的#2是有效的，这支持了在治疗和研究环境中使用FSA 。Betts通过2个案例对FSA 做出了进一步描述。
最近，Mattson和Betts在韩国进行了大规模的FSA 研究。其在小学体系中确定的921个潜在参与者中，对296个非规范性和240个规范性学生的美术作品进行了分析。非规范性样本包括144名发育障碍的学生和152名听力障碍的学生。结果表明，该研究中使用的FSA 评估方法能够区分规范性和非规范性组别。作者得出的结论是，其使用的FSA方法在评估发育障碍和

第25章美术治疗在自闭症谱系障碍患者治疗、评估及研究中的作用 461

听力障碍儿童的认知能力方面取得了成功。
同样，Betts、Schmulevich、Hu、Kelly和 Choi⁵¹] 在一项对美国自闭症患者药物反应的研究中使用了FSA 。Betts 等人的FSA 绘画分析的初步结果显示，许多 FSA 评定量表具有反映自闭症患者的发育水平和认知功能的能力。表25-1 汇总了该研究中57名受试者的数据。
表25-1 与特定诊断类别相关联的量表如第2版FSA评级手册中所描述⁹9]。
以下信息基       于现有认识：每个量表都需要通过研究进一步证实和阐释

评测项目自闭症数据(美国儿童& 青少年)(Betts等，2013;
平均分，N=57) 正常人数据(美国成年人)
(Hamilton,2008;平均分
,N=30)
主导颜色 3 4
颜色搭配 2 4.5
隐含资源 2 4
逻辑性 2.5 4
现实性 1.5 3
发育水平 2 4
物体及环境细节 1 4
线条性质 3 4
持续性 4 5(无)

FSA:案例示例

这两个FSA 系列(图25-1和图25-2)由Frank(化名)完成。 Frank 是一名 20岁的非裔美国男性，患有严重的智力发育迟缓、普遍性发育障碍PPD-NOS 和表达性语言障碍。Frank 的 FSA 绘画反映了他存在回忆和确认面部特征的能力。将在美术治疗开始时完成的Frank 基线FSA (图25- 1)与8个月后完成的第二个FSA 进行对比，结果显示是有意义的。 Frank 在其第一个FSA 系列的第三幅图(图25-1)中做了很有限的涂鸦。8个月后，他绘制了一个被填满的圆圈(图25-2),例证了其精细运动控制和认知-感知能力有所提高。
图25-3和图25-4是Zach(化名)的FSA 绘画。Zach 是一名20岁的非裔美国男性，患有严重的智力发育迟缓和自闭症，他没有语言。他的两个FSA 系列之间存在差异。在基线系列(图25-3)的第三幅绘图中，Zach 描绘了圆圈形状，而在其8个月后完成的系列(图25-4)的第三幅绘图中，显示了Zach 尝试重现一个人的形态，反映了其认知-感知能力的提高。

462             ASD 的个性化治疗和一生不同阶段的议题

图25-1 Frank 的第一次面孔刺激评估系列

图25-2 Frank 的第二次面孔刺激评估系列，于8个月后完成

图25-3 Zach 的第一次面孔刺激评估系列

第25章美术治疗在自闭症谱系障碍患者治疗、评估及研究中的作用 463

图25-4 Zach的第二次面孔刺激评估系列，于8个月后完成

这两个案例反映出一个概念，即标准化美术治疗评定除了其他益处之外，还能够帮助解读随时间产生的变化。其他作者也探讨了适用于ASD 患者的美术治疗评估的这一主题。Silver⁵2] 思考如何通过绘画刺激来表达幻想、认知能力和情感需要，特别是对于那些没语言或有语言障碍的人。 Silver 对此进行了多年的研究，包括在广泛的人群中使用绘画刺激进行的定性和定量研究。她解释了标准化美术治疗评估的益处，例如不同个体如何对相同的绘画任务感知不同，指出通过每个人的绘画可以洞察其个人经历及感受。
Oster 和 Gould 提出，学习如何使用图画进行诊断评估，可为临床医生提供许多通过常规口头检查无法解决或发现问题的机会。他们展示了在临床上使用图画以及应用美术治疗评估的研究。一些被引用的研究显示，绘画是一个人当前功能水平的主要来源，也是表达情感和人际关系问题的相关方法。此外，他们认为绘画可以用作多次测试，以评定功能上随着时间推移的进展或退化。但是，作者注意到尚缺乏对这种评估可靠性和有效性的信息，并强调了继续进行更多研究的必要性。
由于以下研究缺乏评定的标准化实施且所使用的评级系统有效性未得到证实，因此存在很多局限性。鉴此，来自这些研究的数据可能不一定适用。除这些局限性外，以下研究中提供的信息对如何很好地将包含人物形象或肖像的美术治疗评估应用于自闭症患者进行了说明。
例如，Lee 和 Hobson研究了自闭症患者与具有学习障碍的非自闭症个体在人物绘画上的差异。作者受到先前研究的启发，证实自闭症儿童在社会参与和个人关系方面存在缺陷。他们将14名自闭症儿童与14名具有学习障碍的非自闭症儿童进行对比，并要求其完成对人物和房子的绘画。使用Mc- Carthy⁵5的标准化评分程序对图画进行评分，结果显示与人物绘画相比，自闭

464 ASD 的个性化治疗和一生不同阶段的议题

症儿童对不同房子的绘画中表现更精细成熟，而非自闭症儿童则相反。这项研究的局限性在于其样本量很小且没有设定受试者完成绘画的时间，虽然如此，仍有其令人关注的意义。
Lim和Slaughter5⁶ 进行了一项对阿斯伯格综合征患儿人物绘画的研究。作者受到先前研究的启发，发现自闭症儿童的人物绘画在细节上不如正常儿童复杂。他们将29名阿斯伯格综合征患儿与28名相同性别、年龄和非语言性 IQ 正常儿童相对照。美术评估包括自由绘画，然后是人、房子和树的绘画。使用Buck's House-Tree-Person 评分系统[18和 Koppitz 的人物评分系统[57对图像进行评分。结果显示，阿斯伯格综合征患儿的人物绘画不如正常儿童那么复杂，而对比他们房子和树的绘画却是同样复杂的。
Martin[58评估了25名自闭症儿童和青少年以及15名正常儿童的绘画。要求其画出研究人员的面孔。在完成绘画任务的过程中，注意到他们有13个绘画特征和17个行为表现。这个研究受其样本量小、随机选择缺乏和年龄控制不足的局限。尽管存在这些局限，该研究仍得到了有趣的结果。与正常儿童相比ASD患者更多地参与了绘画过程。此外，研究者发现肖像绘画是一种成功地帮助ASD 患者建立关系，同时开发面部识别和处理技能的方法。
未来对自闭症和美术治疗评估的研究应继续对ASD患者常见的艺术天分进行探索。Betts 在面孔刺激评估(Face Stimulus Assessment)中已经取得了一些进展43]。一个相关的研究方向是对等效的图像性自闭症诊断标准(GraphicEquivalentsof DiagnosticCriteriaforAutisticDisorder)⁵9的探索。 Gantt和 Tabone提出了等效的图像性症状“Graphic Equivalents of Symptoms”的概念。在其艺术治疗形式要素量表“FormalElementsArtTherapyScale (FEATS)” 手册中，Gantt 和Tabone 描述了FEATS量表如何“从某种特定疾病的核心症状中逻辑性地衍生”(本章参考文献46的第25页)。然而，Gantt 和 Tabone提醒称，“读者不能假设他们具有统计意义上的相关性，这是未来亟待研究问题(本章参考文献46的第25页)”。因此，基于Gantt 和 Tabone 的观点，表25-2显示了FSA 评分量表如何与自闭症诊断标准相联贯。然而，仍需更多的研究来证实 FSA 量表是否或在什么程度上可能(或不可能)与自闭症的特定标准切实相关。这样的研究将通过获取有效且可靠的资料，例如自闭症诊断观察量表(ADOS)。

第25章美术治疗在自闭症谱系障碍患者治疗、评估及研究中的作用 465

表25-2自闭症障碍的DSM诊断标准图表

299.00自闭症
障碍的 D S M
I V - T R 诊断
分类 299.00自闭症
障碍的 D S M
I V - T R 诊断
标准对美术治疗文
献的观察(Mar-
tin,2009;见附
录A)
FSA评级量表
(需要更多研究
来证实)

社会交互障碍 a.多种非语言行为，如眼神接触、面部表情、身体姿势和手势来调节社会交互的显著障碍
b.无法显现适合发育水平的同伴关系
c.缺乏主动寻求与其他人分享愉悦、兴趣或成就的表现 (例如，缺乏表现、带来或指出感兴趣的事物)
d.缺乏社会或情感互动非典型艺术发展图式僵化 #2颜色恰当
#5现实性
#6发育水平
#7物体和环境的细节

沟通障碍 a.延迟或完全缺乏语言的发育非典型艺术发展 (不伴随试图通过其他交流模想象力(假想)困式进行补偿，如手势或模仿)难的表现
b.在具有适量言语的个体中，在发起或维持与他人的谈话能力方面有显著障碍
c.刻板重复使用语言或特殊语言
d.缺乏与年龄相当的各种自发的装扮游戏或社会模仿功能 #2颜色恰当
#5现实性
#6发展水平
#7物体和环境的
细节
限制性重复及刻板的行为、兴趣和活动模式

智障 a.包括一种或多种异常强烈色序
或超常关注的刻板而局限触觉防御性
兴趣模式             高度细节填充
b.固执的遵循特定的、非功能任性的修正/ 性的惯例或仪式          求全；
c .刻板重复的运动方式(例编目分类；如，手或手指拍动或扭动，图形执拗；或复杂的全身运动)    运动持续；
d.对物体的具体局件的持续模式僵化关注 #1颜色鲜明
#3隐含能量
#4逻辑性
#7物体和环境的细节
#8线条质量 #9持续性
极严重：IQ低于20
严重：20～34
中等：35～49
轻微：50～69
智力功能界线：70~84 非典型艺术发展#5现实性
任性的修正 /#6发育水平求全

466    ASD 的个性化治疗和一生不同阶段的议题

未来方向：美术治疗的研究与自闭症

本章介绍了美术治疗师在针对自闭症患者的治疗、评估和研究方面所面临的挑战和机遇。如果临床美术治疗师和研究人员基于以前的文献逐渐建立知识库，那么未来ASD患者将从中受益。因此，有必要就其未来的发展方向和建议进行简要探讨。
在挑战方面，Martinwww.arttherapy.org 和www.atcb.org)。
Kaiser 和 Deaver⁵对美国美术治疗研究人员进行了Delphi 研究，以确定该专业领域的研究重点。结果确定了“通过定量实验设计确定美术治疗干预与其他形式治疗相比的效果”作为最重要的研究领域(见第6章)。这在Lu 等人221对25名受试者的行动研究，以及Saneei 和 Haghayegh[65对30名自闭症患者与30名正常人进行比较的研究中均有例证。这将受益于进一步的大样本多位点可重复性的定量研究。在推进该专业发展的新兴而拓展性重点研究方面，Kaiser和 Deaver⁵的论文指出美术治疗和神经科学的研究势在必行。自闭症患者是被优先考虑作为最重要的研究目标之一。
在一篇关于自闭症儿童干预研究的综述中，Kassari[66 报告了在精心设计的治疗研究中必不可少的要素，应包括随机化/匹配程序以及更可靠的疗效测量方法，或对于发生的改变的测量。此外，作者强调了增加对疗效认识的重要性，并且表明了难以预测哪些孩子会选择何种类型、多大强度、与其发育行为相称的治疗方式。由于不是所有治疗都测量相同的变量，所以难以对不同治疗方式的效果进行比较。最全面的研究依赖于测量治疗前后的变化，然而 Kassari 解释说因为在治疗过程中发生的变化没有被测量而使得这些研究相当受限。

第25章美术治疗在自闭症谱系障碍患者治疗、评估及研究中的作用 467

神经科学、美术治疗与自闭症

“艺术给这个世界赋予的形式和意义，是无法用语言所形容的”(见第6 章)。Temple Grandin³2解释说，她作为一个患者，是“在图片中思考”(见第1章),并且对感觉刺激特别敏感。通过神经学测试已经发现了 ASD 患者的大脑可能存在结构上的差异。在Grandin 的案例中，她大脑中的分析感觉刺激的区域呈现独特的结构，这一发现对神经科学的研究具有重要意义。此外，新的DSM-V⁶8] 引发了很多争议，这导致了未来研究需要集中在神经和生物学基础上对于疾病的讨论【69]。
神经科学的新兴领域为美术治疗的进一步研究提供了大量机会，一些作者已经开始探索这个有前景的领域。进一步理解大脑，特别是其对自闭症的含义，是一个时机成熟的研究领域。增加对大脑结构及其功能的认识，以及阐明艺术创作过程是如何影响了神经通路，可以改善美术治疗作为自闭症有效治疗的疗效。

本章要点

●美术治疗师是硕士学位专业水平、经过资格认证的临床心理师，他们非常有能力解决自闭症患者的评估和治疗需求。
●美术治疗被广泛地认为有利于治疗自闭症患者，特别是在学校环境中，在那里可以成功地实现生理和社会心理相关的发展目标。
●向公众和利益相关人员宣传，及增加研究基地，将进一步使更多的人意识到美术治疗对自闭症患者有益处，从而使更多的患者获得美术治疗评估和治疗服务。
●文献探索了美术治疗和神经科学的交叉点，这是一个与进一步研究美术治疗如何帮助自闭症患者十分相关的领域。

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附录A:Martin(2009)    自闭症儿童美术作品的特点：术语的定义

自闭症非典型美术发展：一个孩子的成长过程不遵循典型的成长轨迹，却可能出现不寻常或违反常规的特征。这可能包括跳过绘画前期阶段(从随意性的涂鸦到可以辨识的图形，其间很少或没有操练阶段),非常规的主题选择78,或过早成熟的绘画能力(见第3章)。
编目：涉及创建一个利益相互关联的视觉目录，(如，不同种类的火车模型、不同种类的甲虫)。顺序特点和组织类别似乎与持续性相关并且通常按照自己意愿进行(见第3章)。
颜色序列：强迫性按照一个严格的顺序使用颜色(见第3章)。
填鸭式：倾向于关注任务的完成而忽略其质量。孩子绘画时最开始可能很少将注意力放在定位上，很快就没地方画了，然后就把剩下的“填充”上去 (见第3章)。
想象力(假想)的困难：画一些现实中不存在的东西对于许多ASD 患儿是一种挑战(见第3章)79]。
图形执拗：孩子美术作品固定在一个永恒的主题或话题(如，一个电视节目角色、汽车、马、彩虹)。在ASD,这往往要牺牲其他兴趣爱好，从而反映了其呆板和强迫性的行为。这可能与想象力的缺乏或者对于秩序的需求相关(见第3章)。
高度细节：这些孩子往往无法滤掉过多的无关紧要的细节，而是把这些细节包含在他们的艺术作品中；这些孩子通常会发展为有声誉的艺术家。这种行为常常被描述为过度关注或“高保真关注”。这种高度细节化可能与知觉/感知问题、执拗和强迫性行为相关，或者是对秩序和组织的需要，特别是如果它涉及绘制地图或建筑平面图(见第3章)。
强迫性的校正/完成：对绘画中任何感觉到的遗漏容忍力较低，有一种冲动去调整或修正自己的作品或别人的绘画作品的冲动(也不管是否得到别人

第25章美术治疗在自闭症谱系障碍患者治疗、评估及研究中的作用 473

允许)。对于自闭症儿童来说，这似乎持续存在，超出了适当的发育年龄，也可能与强迫症感觉或视觉空间缺陷有关(见第3章)。
模式僵化：是指孩子的图式的停滞。一旦孩子决定如何绘制“人”“房子” 等等，在没有干预的情况下，这些绘画模式的改变都是很小的。这可能与实践缺乏或社会缺陷有关(见第3章)。
触觉防御：触摸的敏感，包括压力、温度或纹理。这可能会影响他们使用特定艺术材料的舒适程度(见第3章)。

第26章

范式转换：我们对成人自闭症的理解

Rhonda J.Greenhaw
孙睿睿孔健译，孔学君校

摘要
本章首先探讨了自闭症成年患者的现状，测试了该群体患者的病史、现状以及未来的走向。接着，讨论了该患病群体被归类于“功能不足”,有待于被“修正”这一事实，并认为这可能并非康复的最佳手段。然后，回顾了成年患者群体的现状，当中多数人难以与社会接轨，但研究发现，一种新的“社会模式” (social model)可适用于该群体，即对这一患者群体的能力进行预评估。这一模式有望为成年人就业、教育、住房等方面提供崭新的前景。
关键词：自闭症谱系疾病；成年自闭症；健全至上；残疾人社会模式；疾病模型；残障人士就业；自我倡导；自闭症的社会影响；向成年人过渡的青年；神经多样性；预估能力

前言

19世纪40年代，当Leo Kanner首次在美国约翰霍普金斯大学(JohnsHop-kins) 的实验室中提出自闭症时，自闭症是如何对个人寿命产生影响尚不清楚[1。直到2010年，在The Atlantic杂志上发表的一篇文章提供了有史以来第一位经Kanner 诊断为自闭症儿童——Donald Gray Triplett 的生活一瞥。文中的 Triplett年龄77岁2,已学会如何驾驶，并在他的生活中从事有意义的活动。在Triplett 之前的许多自闭症患儿，却是在相关机构中度过他们的余生，因为许多被误诊为精神分裂症或其他精神疾病。庆幸的是，许多自闭症谱系儿童现有的生活环境得到显著改善。
今天，许多鲜明的案例展现了自闭症患者如何经历他们的人生、参与有意义的活动，可能最著名的，非65岁的Temple Grandin 博士莫属，她是一名教授、

第26章范式转换：我们对成人自闭症的理解    475

动物驯化师、演说家、社会活动家兼作家。除Grandin 外，在自闭症患者中不断涌现出非常著名的人物，如作家兼演说家JohnElderRobison,如今已56岁，作家兼社会活动家Donna Williams(50 岁),电影 Wretches and Jabberers 的主演 Larry Bissonnette³,在此不多列举。这些成年自闭症患者以及全国范围内自闭症维权者不仅让我们逐渐意识到自闭症不只是儿童疾病，也正逐渐改变我们对这一疾病的认识。
社会上越来越多的人意识到，自闭症患者可以享有和其他人同样完美的生活，但要提高所有自闭症成年患者的生活质量，需要对这一患者群体进行更密切的关注和更多的研究。现估计，每年约50000名自闭症青年患者年过18 岁，且如前诊断为自闭症的人数有所增加，并持续增长4。考虑到诊断为自闭症的患者数目有所增长，为能顺利提供专属于他们的教育机会、工作场所和环境，进一步了解他们目前面临的问题、挑战和需求至关重要。本章回顾了自闭症成年患者目前面临的问题、成人自闭症群体研究的进展，探索了未来研究的方向。

影响自闭症成年群体的几个方面

尽管生活阅历、教育及与其他人的互动均能塑造、影响年轻人的性格，自闭症患者在其儿童和成年时期会面临一些特有的经历和挑战，具体阐释如下。
童年时期接受药物等治疗
对于逐渐增多的自闭症儿童，他们的童年充斥了药物疗法、其他治疗手段和相关服务。从最初步入儿童时期即被归类于自闭症，经历整个童年阶段，甚至今后生活的各阶段，他们不断被评估，被认为是功能“缺损”或“不足”。目前，科学家们已能够在儿童步入青年期间鉴别其是否患有自闭症。专家们还近乎开发出用于自闭症的血样检测，甚至在未来能够对自闭症进行子宫内检测。对儿童和幼儿自闭症的早期诊断如今已被认为对于早期干预治疗自闭症患儿至关重要。虽然一些采用积极行为疗法的举措非常有效、受用，但另有一些却采用消极治疗和惩罚手段，对自闭症患儿进行培训以压制他们的自闭倾向。
许多成年患者群体抱怨这类方法会对自闭症儿童造成伤害5-7]。网络上可以找到关于应用行为分析(applied behavior analysis,ABA)治疗的交谈，例如，自闭症成年患者将这些疗法比作是同性恋转换治疗，已经广受质疑。事实上，IvarLovaas,是将ABA方法用于治疗自闭症患儿的第一人，同时也是女性特质明显的男孩研究项目(theFeminineBoysProject)的主要研究人员，这两项

476    ASD 的个性化治疗和一生不同阶段的议题

研究均以治疗为目的，旨在将有疾病倾向的儿童从发育正常同龄人中辨别出来9]。广为人知的同性恋转换疗法(Gayconversiontherapy),已受到如美国精神病协会、美国儿童学会、美国心理协会及其他组织等在内的专业协会的谴责；虽然采取惩罚和消极手段治疗已越来越少见，但这些手段仍被用于自闭症患儿的治疗中。
此外，还有其他治疗方法和手段同样能够降低自闭症患儿的生活质量。例如，严格控制或限制自闭症患儿的饮食，或给其服用大剂量高强度的药物，或参与高强度试验，或采用未经预实验但有潜在危害的治疗方法，如使用螯合剂，其曾被用于治疗重金属中毒致生命受到威胁的情况，已导致至少1名自闭症患儿死亡[11。除明显有害作用外，尚不清楚不同处方药对儿童生理、神经、心理发育的长期影响。并且，即便治疗风险性小，但是占据了儿童生活中大量的时间。较为常见的是，接受治疗的自闭症患儿在一周内白天上学，在整个晚上都接受治疗。据多位自闭症成年患者报道，这些治疗经历以及一味固执的自闭症治疗、让他们和正常青年看齐的各种干预，给了他们很大的压力，甚至使他们产生了绝望和自我厌恶感，而且这种负性情绪持续贯穿于他们终生5,7。
受欺凌、虐待和被孤立
许多自闭症患者受过欺凌的发生率远高于正常人。自闭症互动网络(TheInteractive Autism Network)的研究对家庭进行了一项调查发现，63%的家庭报道他们的自闭症患儿曾受到过欺凌，且欺凌现象在中学中最常见1³。欺凌对生理和精神健康均可造成影响，且经历欺凌遭遇的儿童更易患头痛、胃痛、焦虑，也更容易自杀。在上学期间遭遇过欺凌的自闭症青年患者在他们今后的人生中一定会受到这些经历累积效应的影响，最终变得多疑、感到绝望。
自闭症成年患者较普通人更多经历过虐童事件，往往曾经受过监护人、老师、父母、或其他家庭成员的虐待。儿童受虐往往在多方面受到影响，包括压力增大，高度觉醒，难以调控情绪，依赖性增强，孤立感增强，更易冲动等15。
除受欺凌外，难以置信的是自闭症青年患者是一个被孤立的群体，甚至多于其他智力障碍青年[16。例如，约50%的自闭症成年患者与朋友缺乏联系，包括电话或接受邀请参加活动，而仅有17%伴智力障碍的青年人士有这种孤立的经历。这除了由于自闭症患儿更常在隔离的环境下接受教育，导致自闭症患者在其童年和青春期全程不断地经历这种孤立，其累积程度难以置信，这样只会加剧毕业后青年时期的孤立感。因此，自闭症相关的社交和理解能力方面面临的挑战往往混杂着社会孤立感。并且，自闭症成年患者还缺乏与朋

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友、知己之间的社交网络，因为朋友、知己能够在关键时期如求职、住房或提供社会反馈等方面提供大量帮助。
共病问题
共生的健康和精神问题是自闭症青年患者生活上较为突出的特点，对其个人、家庭和监护人造成了其他复杂的影响。大多数自闭症患儿合并一种发育性疾病，有四分之一患儿合并两种或多种疾病17]。最常见的合并症包括语言障碍、智力障碍、注意力不足多动症(attentiondeficithyperactivitydisorder, ADHD)、感觉整合(sensoryintegration)、学习障碍、对立违抗性障碍 (oppositionaldefiantdisorder,ODD)、焦虑、情志障碍、情绪病、强迫症(obsessivecompulsive disorder,OCD)、抑郁、癫痫和脑病。
若常有被孤立、受欺凌和受虐的经历，长大后可导致创伤后精神紧张性精神障碍(post-traumaticstressdisorder,PTSD)并持续到成年1,这一发现越来越受到自闭症自我维权者和研究者的重视。近期研究表明，自闭症患者自杀的风险率是普通人的28倍19]。当采取治疗措施、拟定方案或尝试理解自闭症患者的真实经历时，有必要考虑这些精神健康问题。为治愈这些患者提供更好的证据支持，自闭症和PTSD 成年患者的创伤经历是如何在自闭症患病群体中体现出来的有待更多的研究。

住房

新的研究表明，自闭症患者较学习障碍、智力障碍或情绪受困扰者，独居的可能性较小，取而代之，会选择和他们的家人长住或和其他障碍人士一起居住20]。事实上，虽然一些自闭症患者可能选择待在家这类熟悉和舒适的环境中，但也有其他因素使得他们无法独立居住，可能是缺乏支持，如个人陪护、经济上的考虑等。
对于该患病群体有不同的关于住房问题的解决办法。为了解患者对居住模式的选择，宾夕法尼亚州开展了一项住宅模式的调查发现，自闭症患者主要有7种不同类型的居住方式：居住在家中，和家庭成员一起居住，租一个公寓或者一套房子，购置一套房子，和别人合租，和特定的人群群居，居住在授权机构[21。
总统Barak Obama称2009年为残障人士的社区生活年(the Year of Com- munityLiving),许诺美国司法部将要求最高法庭施行 Olmstead v.L.C. 决议22]。在1999年0lmstead决议中，法庭于美国残障法案(theAmericanswith DisabilitiesAct)第二条(Title Ⅱ)规定，各州确保为残障人士提供最大限度的服

务。这些重大决定体现了美国政策朝残障人士的态度发生重要转变，最终将强制各州遵守相应规定。
尽管大多自闭症患者在成年时期和家人居住在一起，仍存在一个问题，即许多自闭症患者的父母年迈，在某种程度上无法照顾他们已成年的患病子女。残障是任何人可在任何时间出现的一种少有的状态，人们更容易在他们成年时出现残疾。对于家中有深受影响且需要全天关怀和帮助的自闭症患儿的家庭，就出现了一个艰难的困境。而越来越多的自闭症患儿步入成年，这是一个需要更多关怀的群体。不仅仅为需要大量帮助和关怀，并希望和日渐年迈的父母居住的患者提供帮助，还要使期望独立居住的自闭症患者的能力维持现有水平，这就要求我国需要分配给该地区更多的住房和居住资源，以满足日益增长的需求。

教育

处于过渡时期的年轻患者群体
自闭症患者从小学到高中上学期间，常通过个体化教育计划 (individualizededucationplan,IEP)对其受教育经历进行管理。由授课老师、治疗师、校方管理者、父母和自闭症患儿组成一支多学科成员组，共同实施这项计划。成立该组旨在为自闭症患儿提供服务，包括制定适合患儿的课程，促进其参与学校活动，增进校内经历。许多加入IEP 的学生进入高中，直到他们21 岁上中学年龄期满为止。意在确保残障学生能够拥有更多的校内时间，因为他们可能需要完成学历、获取学位证书。且这样还能允许他们获得在高等教育期间所无法享有的支持和帮助。然而，这一政策意外导致的一个后果是，自闭症患者和其他残障人士的同龄人于17岁或18岁进入大学，而他们的步伐相对滞后，需要在高中多待几年，这将加剧他们被孤立的感觉。
对于16岁或年长的学生，残障人士教育法案(the Individuals with DisabilitiesEducationAct,IDEA,2004)要求成人过渡服务成为IEP 会议的必需内容。成人过渡计划服务旨在为儿童患者中学后生活树立目标：是否进入大学，或职业培训，或正式工作。然而，常有自闭症学生因为没有对中学后生活作具体规划而错失进一步受教育的经历。尽管有要求，向成年转型往往未能在IEP 会议和计划项目中详细阐述，而患儿、其父母、相应的专家也逐渐意识到这是一个需要更多关注和资源的领域。
高等教育深造的新选择
以往，认知异常患者常常被高等院校拒之门外。自闭症患者升入高等或

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大专院校的入学率显著低于普通人，甚至鲜有拿到学位者[4。然而，这一事实开始转变，因为有更多服务致力于为自闭症等发育性障碍患者提供进入高等教育机构的机遇。许多高等大专院校有能够为自闭症患者提供高等教育经历的项目。目前存在的大多项目模式，包括州政府资助项目、高等大专院校经营管理项目和私立非盈利或盈利项目。这样的服务花费从免费到每学期4万美金不等。项目可以提供的最基本服务，如为这类特殊学生提供校园社交组织，也可以为学生提供高强度水平的全方位服务。这些服务，小至社会互动和交流，大至入学一对一帮助，能够为完成高等教育有困难的患者群体提供支持和帮助。
联邦政府还通过为全国许多大中专院校认证项目提供联邦财政资助，以为进展性障碍患者提供高等教育支持。这些项目不仅提供专业课程，还为特殊人士提供如生活、社会技能课程。一些项目提供校园内住宿，虽然当中一些为分隔的独立寝室，甚至为校外酒店，而非传统的学生公寓。在这些项目中，学生能够从被综合性转型和高等教育项目(comprehensive transition and posts- econdary,CTP)认证的学校中获得经济资助。社区大学也开始为这类学生群体提供更多帮助，越来越多的项目提供超出传统的残障人士资助项目外其他的支持。
除了校园授课外，许多学生可参加网络课堂。无论是为这类学生作常规规划，还是作特殊打算，在线学位认证项目可以是感觉、交流或行为有别于常人者不错的选择。往往，大中专院校是一个嘈杂、喧闹、困惑和有一定束缚性的场所，对于一些学生而言，在线教育能够提供另一种可能更适合他们的选择。
高等教育培训的选择
除专业项目外，还有一些为这类特殊学生提供高等教育培训的项目。这些项目可以提供特殊需要，如语言学习或社交互动，或在某一特殊领域提供无需承担学分要求的课程，如电脑动画。一些项目是在大学校园里开展，其他项目由组织机构或者私人企业管理负责。小部分项目允许没有自闭症的学生参加，是作为自闭症成年患者的陪伴人员参与。这几类项目为成年患者获得社会知识和社群联系的特有经历提供了重要的机遇。
虽然目前没有足够多的资源以满足这一成年群体对高等教育日益增长的需求，这将是一个在美国乃至全世界不断发展的新项目，具有广大发展前景的领域。高等教育选择的增多令人可喜，而曾经这些患者被放逐到沉闷的、为其将来发展提供极其有限机遇的职业康复项目的日子已渐行渐远。能够如雨后春笋般涌现更多高等教育的选择机会，有赖于更多的社会支持，以满足日益增

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长的需求。

就业

自闭症成年患者在实现自主创业工作的美国梦时，面临巨大障碍。2011 年，一研究小组对自闭症成年患者的现状进行综合性调查。在就业领域，研究人员发现，超过一半的学生大学毕业后2年内未能找到工作，远多于国内其他残障人群[25。丝毫不令人惊讶的是，研究人员发现，那些来自社会经济背景低的家庭的学生境遇更为糟糕。其他研究也报道，这一患者群体的就业率显著低于普通人，成为影响自闭症成年患者的重大问题[26。
做某一领域的全职工作对于自闭症患者来说会面临几项挑战。这些挑战包括就业或与神经发育性异常患者互动面临的谴责和恐慌，神经发育性异常患者不得不在掌握重要决定权的上位者面前展现自己，他们在就业过程中难以灵活机动，自闭症还面临一些挑战，如一些特定的工作环境可能加剧其感觉信号处理障碍，又如工作面试时的沟通障碍，以及工作资助上的资金不足等。
自闭症成年患者，在过去常参与名为“庇护工厂”(sheltered workshops)的工作项目。“庇护工厂”的构想旨在为被认定为“无法工作”的患者提供就业前培训、技能培养，或仅教其日常所需技能。有时候这些付出得以回报，但患者的工作往往乏味、低能，且薪酬远低于最低收入。并且，这些环境是高度隔离的，易造成患者被孤立的感觉。为解决上述这些及其他存在的问题，全国几个州将对“庇护工厂”的资助，向在具有竞争力的市场上提倡有偿就业的系统转移。
自闭症患者得益于从“庇护工厂”制造工作的世界中转向他们自己专属的就业市场。事实上，近期一项研究表明，自闭症患者在工厂中境遇更为糟糕，不仅收入相当低，且在就业庇护场所耗费的资助资金高于辅助就业环境的耗资。并且，在“庇护工厂”不允许个体差异和个人兴趣爱好，而这些对于自闭症患者更好地发展自己至关重要。
全国正开展帮助自闭症成年患者、整合资源的新模式，因为这一患者群体以及他们的家庭更希望寻求更有创造力的就业选择，以充分利用他们的能力和兴趣爱好，并能够较少地依赖于限制严格的工作项目。这些就业选择得到相关研究机构强有力的资助，也越来越多地得到州立和联邦政府、倡导根据自闭症患者自己的意愿为他们寻求有薪工作的组织的支持，越来越多有创造力的解决办法正在这一患者群体中开展。

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就业支持
一些自闭症患者可得益于“就业支持”项目。这些项目在教育评估、履历培养、入职前技能培养、现场培训等多个领域为患者群体或个人提供帮助，当他们一旦求职成功后，还会给予持续帮助，以帮助个体顺利进行工作。往往，就业支持项目会给个人提供执业教练(job coach)或就业专家(employment specialist),他们陪同患者去其工作场所，在其进行业务学习时为其提供帮助和支持，以使其适应相应的工种。较为理想的是，执业教练为患者提供的支持会越来越少，直到对方最终能够独立完成工作为止。一名优秀的就业专家/执业教练还能够帮助患者在工作中逐渐掌握自我保护的能力，以及如何与其他同事、领导、客户等处理好人际关系。
基于工作的学习和就业试验
与在课堂授课培训不同，基于工作的学习和执业试验能够为患者熟练掌握特定环境中的工作提供机遇。对于自闭症患者个体而言，在工作中学习该行业知识有利于其工作技能的发展。在工作中学习时，其他同事或执业教练可以陪伴患者作业，在他们提高工作能力的过程中担任导师或范例的角色。
基于工作的学习和就业试验还有另一优势，即允许这类患者群体尝试本职位相关的不同作业，有助于判断这项工作和环境是否适合他们。这种情形可解决通过评估判断该个体实际能够从事的职业、兴趣或能力与其提供的个人信息不相符的情况。例如，自闭症患者可能有沟通异常，使得传统的评估方法无法适用。基于工作的学习能够为个体提供体验该职位的机会，并提供做出工作和事业相关决定的重要反馈。
基于工作的学习还能够为雇主提供认识自闭症患者的机会，可有助于改善雇主及其他员工对于自闭症个体胜任某个特定工作的能力的担心与恐慌，这有助于为那些不适合在传统评估/面试方法下进行应聘的自闭症患者打开方便之门，并创造机遇。
“量身定制”的就业
竞争上岗和庇护工厂最主要的区别是，对于竞争就业，会根据工作场所的需求择人就业，而庇护工厂是根据这类就业群体的需要分配适合的工作[283。在制定的就业环境中，作业是从几种不同职业中挑选出，或被再分配。这意味着，通过一种独特的方式构成作业，使得患者的技能、兴趣爱好、擅长之处得到最大化利用。例如，如果这类群体中有能够熟练创建电子数据表独特天赋者，定制的就业解决办法可以是为这样的人开辟或重配一个专门制作电子数据表

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的部门，这样可以解放其他员工用以专注于其他方面的工作。另一个定制就业的例子是，一名无法言语的成年患者，可能在零售业的各个环节，或在与客户沟通交流上有巨大挑战，但他可以被派去管理储藏室，以开发其管理、整理物品的专长。
为自闭症患者或其他残障人士定制就业的想法，以及基于工作的学习方法是美国工作环境中提出的新理念，如何成功地引导这一类型的工作重组，仍有待更多的研究和探索。然而，无论是为丰富这一群体的个人经历，还是从老板和员工的角度，都能够真正地为这类患者群体提供更有效力的帮助，创造更多不同的机会。

自闭症成年患者的未来走向

转化研究
根据美国国立卫生院(NIH)在2009年指出，转化研究致力于两个领域：开展实验室研究，并将其应用于指导人类研究，通过采用目前所知的用于临床实践的最佳模式进行基础研究31]。在自闭症研究领域，迅速涌现出一批对自闭症患者大脑拓扑结构进行的研究，该领域研究人员发现，自闭症患者大脑与普通人相比，其发育和功能均有所不同³²]。转化研究为临床医生和科研工作者提供了有助于理解自闭症患者行为的重要信息。
对于自闭症成年患者，转化研究有望发掘最佳实践模式。关于脑功能的科学发现可共同用于开发更好的评估工具、专业指导和工作相关的住房，以及培训方法。这些措施的诸多益处，能够改善自闭症患者的预后，并为打造完全融合及通达的社会提供重要信息。
并且，研究还可开发新的药物疗法，并用以改善自闭症患者感觉受迫症状，治疗其合并症，减轻其他难以言表的自闭症状。此外，对转化研究越来越多的经济资助可以省下大量经费，用以培育更为有效的疗法以改善预后，减轻患者对外界帮助的依赖性，如成年患者有意独立居住和工作所获得的个人帮助。
精神病学
今年美国精神病协会(theAmericanPsychiatricAssociation,APA)拟发布第五版疾病诊断和统计手册(thefifthDiagnosticandStatisticalManual,DSM-V), 作为专家对精神健康类疾病进行诊断、分类的参考用书。协会所推崇的有关自闭症的内容在自闭症群体中引起热议33。新版去除了将Asperger's 作为一

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种诊断类别，这是在自闭症患者中引起重要影响的一个概念性转变，因为许多诊断为Asperger 综合征的患者坚持他们的诊断结果，并感到与其他类似诊断的群体有着紧密的联系。
这一版本发布遭到美国国家精神卫生研究所(theNationalInstitutesofMental Health,NIMH)Thomas R.Insel 主任的更多的批判。 Insel严词回应了 DSM-V 的分类方法，他呼吁科学界人士将“缺乏有效性”(Insel认为)的评估移除，更正为“基于已有的研究数据，无法将其归于目前症状相关的类别”。 Insel向科学界提出挑战，认为分类应根据“基因、影像、生理和认知的数据”, 而不仅是根据一组症状35]。
除了Insel 提出需对手册作修改外，许多自闭症患者也赞成应作一些改变，称自闭症研究需要更多的患者参与。通过与自闭症患者商讨他们的需求以更好地在世界上实现他们的价值，可更有效地采取相应措施、评估、治疗，因为自闭症个体本身对其受神经差异的影响有着直接感触。
接纳残障人士的社会模式
自从残障人士权利运动以来，残障人士的社会模式引起大量的研究兴趣。就自闭症而言，许多自闭症维权者同意并坚信，残障人士的医疗模式代表着一种视残障患者为不良的、损坏了的或需治愈的群体的一种模式。残障患者社会模式的理念，旨在残障群体本身不会将残障视为问题，并将残障有关的挑战视为源自社会所认为、对待残障的态度引起36]。
残障人士的社会模式意识到以前及现在对残障人士能力的歧视或偏见，这些看法有时候被指“健全至上”“ableism”和“disableism”,这一模式能够正视并消除对他们的不公，对成年患者有着重要的影响。例如，这一模式能够孕育出新的治疗方法、评估手段以及数据采集方法，把自闭症患者看成是自己生活的代理人。这一模式拟基于个人兴趣爱好促进其学习，采用积极的行为帮助，以及消除隔离式的教育及个人生活环境、以开辟出对自闭症患者更为尊重的路径。
在残障人士的社会模式中，自我决定具有显著价值。在这一模式中，传授决策才能、自我意识和自我倡导成为教育、为成年自闭症患者提供帮助规划中不可或缺的部分，可积极地改善他们与家人、关怀人士、其他年轻患者的关系。
对于自闭症维权者来说，残障人士的社会模式中存在一些极其重要的元素，讨论如下。
对能力的预估：很难断定自闭症患者的智力，尤其是对沟通异常的患者 (Dawson,Soulieres,Gernsbacher,Mottron,2007) 。因此，当与自闭症患者互动时，确有必要对其能力进行预估。在这类评估中，我们应该知道选择交流的方

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式，从自闭症这类残障人士的角度考虑，并为其提供服务。在残障人士的社会模式中，幼儿化(infantilization),即残障人士被像对待儿童一样对待，或无法自己作决定，则被认为是包括自闭症在内的残障人士的最大障碍。为对其进行治疗、教育和干预的有效，在此之前均需要对其进行能力评估。
父母、老师、治疗师和同龄人根据与患者的相处，对其缺乏的能力进行预估。这些评估无法精确地描绘残障患者，有可能成为专业实操中的障碍。例如，对于无法进行言语沟通的自闭症患者，其老师可能设想该患者无法理解语言，然而自闭症患者常常对获得性理解有质疑的能力。这一预设的结果便是，不会将教室里某些资料或课程介绍给患者，这会阻碍其获得重要的学习信息。
神经多样性和多角度评估：残障人士的医疗模式视自闭症为发育过程中的一类偏差；这些异常，如自闭症等被认为是身体和大脑的功能障碍(dis- ordered) 。残障人士的社会模式理解为其是人类生物多样性很自然的一部分。诚如生物学家很早就意识到表现多样的物种生命更为顽强。这塑造了生物抵御疾病和环境改变的能力。与其试着将自闭症患者趋于与单一标准下的普通人一致，不如认为神经多样性原则允许出现自闭症患者的异常表现，且倾向理解为这些异常对于我们整个物种有着重要价值。神经多样化的个体能够展现其独特多变的角度，而这些多面性是有价值的，应被归于社会的各个方面中。
自我决定：残障人士的医疗模式难以做到康复和自我决定二者的平衡 (Bannerman,Sheldon,Sherman    &Harchik,1990)。虽然残障人士的社会模式认为，自我决定是他们的基本权利。医学康复认为，残障人士在一些方面存在能力缺陷，阻碍了其独立性，需要制定实施治疗方案改善其症状，即便他们拒绝这种治疗(Bannerman et al.,1990)。社会模式强调了自我决定的重要性，认为能够自我主导生活各方面的能力，是值得推崇的，也应当用以指导如何支持和帮助残障人士。自我决定的理念源于对自闭症患者才是唯一真正地能够完全懂得其生活经历、需要、兴趣爱好的理解；其他人可以感同身受，但无法完全体会他们的经历，因此，自闭症患者面临其个人生活中的抉择，应当作自我指导和决定。
融入社会：残障人士的社会模式倡导的理念是，社会多样性应得到高度重视。各种不同的个体有权利和其他同龄人一样，参与各项社会活动并完全融入社会的各个方面。社会融入与社会歧视相对立，社会歧视是将残障人士排除在外，并区别对待36]。有权融入社会是以“隔离是不平等的”理念为前提，残障人士在入学、就业、社区等各种环境中享有社会融人的权利是

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一种人权，这必须贯彻到底。社会融入也有益于非残障人士及整个社会，已有研究表明，与同龄的残障儿童一同接受教育，能提升正常儿童的社会同情心和自信心。对于自闭症成年患者，能够融入社会就能够减轻他们的孤独感和被孤立的情形，提供给他们重要的社交网络和社会联系，以提升他们的社会决策能力。
通用型设计：为了促进残疾人士有平等机会进入社会，残疾人士社会模式的一个内在方面，通用型设计应当融于生活的方方面面。对于自闭症患者，拥有减少感觉障碍影响的空间，掌握多样化的信息以适应交流方式的不同，能够为其融入普通人行列创造机遇。在新项目的设计阶段，将自闭症患者及其他残障人士纳入考虑，如建筑或设置课程，能够通过掌握更为有价值的信息渠道，制造出适合广大使用者的终端产品。这样还可以使项目拥有更大价值，同时减少了为配合多样化群体而追溯调整的需求，节省了时间和金钱。有一个很好的例子，目前美国拥有住宅的人们已耗费了数十亿美金建造房屋，使其适于接纳正在老龄化的婴儿潮人口。如果通用型设计已成为房屋建造的一部分，在设计初始阶段便将适宜入住考虑其中，便可降低可支付的门槛，做到天衣无缝地整合资源。
自我倡导和社区维护：在实现自我决定价值的基础上，建立自我倡导是残障人士的首要行动。自闭症患者在实践过程中，自我倡导有助于判别自我决定受阻的经历和情形，然后以某种方式采取行动消除或改变这些障碍。例如，一个人对其残疾状态的自我揭示，有助于其从美国残疾人法案中获得特别关照以能适应饮食起居，如在受感觉处理障碍影响时稍加休息，这对于患者在特定场合能以正常活动非常关键。
当聚集在整个残障群体中，为自己维权倡导的个人行为，就可使更多的残障群体受益。例如，在工作场所中提出个人请求需要关照，可让所有无残障的同僚受教，也更易于为他人得到类似关照铺平道路。并且，自我倡导是越来越多的残障人士争取其公民权利的结果，过去社会上曾发生过，今天仍在上演。美国残疾人法案和其他法律规章得以施行以维护残障人士的权利源于残障人士权利运动的自我和群体倡导。
以人为导向的生活和以人为核心的计划方案：如能够像非残障人士一样，只要他们愿意，可毫无代价地体验他们的生活，残障人士的社会模式旨在使残障人士能够主宰他们自己的生活。以人为核心的计划方案是自我决定和以人为导向方针的体现；对于有赖他人指导生活的残障人士，应能够获得他们所认为重要的、有帮助的资源和支持。治疗应当由残障人士决定，且治疗的主要功能在于理解他们所要帮助的人士的想法。

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自闭症的个性特质和内在的不同不能被当做是一种缺陷，项目和教育教会他们自我意识，可帮助自闭症患者学习他们所感兴趣、能让他们快乐自信的内容，这反而能够有助于其获得技能和自身发展。将自闭症的医疗模式向社会模式转变，有助于为理解这一患者群体的多样性和与众不同提供一种新方法。
对于已知创伤的疗伤规划

自闭症患者可能有受虐待、被孤立和受凌辱等经历遗留下的严重创伤。并且，医疗模式强调评估和患者识别能力不足，给患者徒增了压力和创伤。治疗包括了依从性训练和严格、过度约束的教育经历，即便是用来提高康复治疗，也可导致患者依赖、缺乏自我意识。
所有这些经历易在一个人的一生中产生总体效应，可导致诸如抑郁和创伤后精神紧张性精神障碍等并发症。自闭症年轻患者还可能经历受质疑，这可能使他们养成应对这些问题的行为习惯，以调节这些经历带来的影响。规划新模式考虑应改善自闭症成年患者所受的影响。允许患者体验自我导向的经历，做到行动自由，为患者提供个人表现的空间，加强对信效度的探索。关怀人士、老师、治疗师也应当认识到，从前所认为的自闭症患者单纯的行为表现可能源于曾经的受阻和创伤经历。
科技和社会媒体以及伙伴的帮助

最令人激动的是，给予自闭症成年患者无限帮助的科学技术、社会媒体和同伴的互助研究进展突飞猛进。科学技术，如能够预测的打字软件、打字转化为发声的语音软件、能够提供特异性帮助的应用程序，以及iPad 和其他高科技设备，将彻底改变患者的生活。就社交领域，例如科技能够为无法言语交流的年轻成人患者提供与外界沟通的手段。与之前模式的耗资相比，触摸设备上的社交应用程序将节省数以千计的美金，适合广大患者群体使用。
引导交流作为一种交流辅助手段，能够使患者在物理辅助下可以打字，有研究表明，引导者事实上是沟通者，而不是患者。这使得该领域里许多人忽略了打字的辅助结合。然而，一组高质量病例报道发现，言语障碍患者如 CarlyFleishman, 能够独立学习打字，引发人们重新思考帮助学习打字作为教授其独立打字的一种手段的价值37]。 CarlyFleishman 直到成长为青少年为止，都主要通过动作进行交流，因而被认为只有儿童般心智。当她开始独立打字时，她向全世界清楚地展示了她无限的才能。如今她在多伦多的一所大学，在她父

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亲的帮助下写了一本自传。Carly, 以及许多和她一样的人，已经学会借助科技和世界进行交流联系，由此表明，世界上有关对无法语言表达者智力的猜想可能大部分都不正确。
社会传媒是改变这类群体现状的另一个媒介。 Facebook,Twitter, YouTube,以及其他社会媒体网站为自闭症患者提供了重要的论坛，以便其自由表达他们的想法，如在媒体上留言和联系他人。这为成年自我倡导者提供了对媒体舆论监察、反映其不同观点、让大众了解他们经历的机遇。
同伴的帮助，是指普通人和其他自闭症成年患者之间。对于未来科研和项目规划来说，这是一个无限待开发的领域。在过去，通常认为自闭症患者不擅长社交；然而，越来越多的关注发现，成年自闭症患者十分乐意和他们的同龄人沟通联系。这为成年自闭症患者的教育提供了康庄大道，他们在过去常被社会孤立，或被认为感觉信号处理异常，因此可能错过了社会传统和期许的重要信息。
自闭症引起越来越多的研究兴趣，因为社会认识到自闭症不仅仅是一种儿童发育障碍。自闭症可从儿童时期一直延续到成年，因此对患者的项目规划、教育经历、治疗措施，以及其他帮助必须意识到单纯将对其儿童时期的功能训练延续到其成年并不合适。如何发展最佳模式以和有人道意识和自我决定权的这类群体一道工作将一直成为一种挑战。成年自闭症患者理应得到和普通人一样的尊重。基于兴趣爱好的规划若能广纳可靠之才，深刻理解残障人士的感受需求，意识到他们的经历造成的累积影响，则能够推动这一类年轻群体的个人成长和发展，为他们实现有价值意义的生活、完全融入群体提供指导。

本章要点

●在自闭症儿童成为许多研究的焦点、被给予帮助和支持的同时，成年患者人数迅速增长，并在自闭症群体中占据主要部分。
●这个迅速增长的年轻成人群体的生活质量、需求和被给予的支持服务迄今很少受到关注。
●从童年时代开始，太多自闭症患儿被认为是“缺陷”和有待通过大量药物治疗和其他干预手段“亟需被修正”,而这些“修正”措施是目前所流行的残障人士“医疗模式”的主要方法。
● 采用残障人士的社会模式是评估自闭症患者能力(presumption of compe- tence) 并发展他们特长的首要前提。越来越多的证据支持这一模式，认为

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即便这类群体无法言语，且被当做智力不足，但当给予适合他们的机会去自我表达、融入更大社区中，他们能够展现出自己深刻的思想和巨大的潜能。
●从成年自闭症患者角度考虑，需要指出的问题是，这一群体的住房、教育、就业机会，所有需要寻求最佳解决办法的这一切均被忽视并得不到尊重。
●为推动发展，成年自闭症患者的转型研究不仅应解决上述问题，还应寻求最佳发展战略，将这类群体更好地融入普通群体中，通过通用型设计以为其提供机会，使其和普通人一样享有平等的求职、拓展等其他机会。

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自
FrontiersinAutismResearch

诊断治疗新视里
New Horizons for
Diagnosis and Treatmer

自闭症谱系障碍(ASD) 正快速地成为影响儿童和成人的发病率最高的神经发育病之一。尽管其被报道的病例数急剧上升并带有很高的遗传相关性，我们对其病因、生中的病情发展及内在和环境等可能增加发病风险的诸多因素所知甚少。目前，对 AS我们既无确认的可用于诊断性筛选的生物标记，又无特异性的良药。由于多数患者的病机理不清，ASD的诊断主要基于功能和行为异常的报告，其治疗也基本上依靠经验摸索。这些不确定性部分缘于 ASD 在临床和表型上的差异很大。所幸的是，在找寻病基因、代谢通路，以及被自闭症所扰乱的细胞和组织功能方面人们已经取得了进展有证据表明，针对某些遗传上可确定的病症及功能失常的信号通路的特异性治疗能ASD里的某些亚型有良好的效果。

本书重点介绍 ASD 研究的一些新兴和快速发展的领域，以及其对开发更好的诊方法和更有效的治疗方法的潜能。这些以患者为主要考量的研究领域包括了创新和整遗传/基因组学的分析，表观遗传学方面的工作(包括非编码的RNA、DNA 的甲基化、选择性剪接、 RNA的编辑及基因表达和调节方面的翻译错误),代谢和免疫的功能异常共病，以及激素和基因-环境间的相互作用而可能导致 ASD 的致病风险增加。

每一章里，专家们回顾了在相关领域的最新研究，同时展望了该领域的发展方向，其中包括会遇到的挑战，需要何种类型的研究或进展以推动该领域的发展进而达到预的目标。

由于书中的许多章节探讨了关于新的治疗策略和其他实用的干预方法的研究，我预期本书不仅对从事自闭症研究的学生和资深科研工作者具有参考价值，还会使社会众，尤其是自闭症患者的家庭和专业护理人员从中受益。

策划编辑饶红梅张凤新责任编辑雍懿饶红梅封面设计大漢方圆
李蹊版式设计郑阳

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