自闭症谱系障碍中的叶酸受体 α 自身抗体：诊断、治疗和预防

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Folate Receptor Alpha Autoantibodies in Autism Spectrum Disorders: Diagnosis, Treatment and Prevention


自闭症谱系障碍中的叶酸受体 α 自身抗体：诊断、治疗和预防
由娜塔莎·博布罗夫斯基-库里1,文森特·拉迈克斯2,杰弗里·塞奎拉3和爱德华·夸罗斯3,*
1纽约州立大学下州医学中心研究生院，布鲁克林，纽约 11203，美国
2The Autism Center， University of Liège， 4000 Liège， 比利时
3纽约州立大学下州医学中心医学系，美国布鲁克林 11203
*通信应收件人的作者。
J. Pers. Med. 2021， 11（8）， 710;https://doi.org/10.3390/jpm11080710
收到意见书：2021 年 6 月 27 日 / 修订日期：2021 年 7 月 20 日 / 录用日期： 2021-07-21 / 已发布： 24 七月 2021
（本文属于特刊：自闭症谱系障碍诊断和管理的个性化医学方法)
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抽象
叶酸缺乏和叶酸受体自身免疫性疾病是导致不孕症、妊娠相关并发症和胎儿发育异常（包括大脑结构和功能异常）的主要因素。食物强化和产前补充叶酸降低了神经管缺陷 （NTD） 妊娠的发生率，但在存在叶酸受体自身抗体 （FRAb） 的情况下不太可能预防妊娠相关并发症。在怀孕期间，这些自身抗体可以阻止叶酸向胎儿的运输，在幼儿中，可以阻止叶酸向大脑的运输。这些抗体普遍存在于神经管缺陷妊娠和发育障碍中，例如脑叶酸缺乏症 （CFD） 综合征和自闭症谱系障碍 （ASD）。在后一种情况下，亚叶酸治疗已显示出一些核心 ASD 缺陷的临床改善。叶酸受体自身抗体的早期检测和干预可能会产生积极的结果。本综述讨论了在有神经管缺陷妊娠史的妇女中首次发现 FRAb 以及 FRAb 与生育力低下和早产的关系。大约 70% 的诊断为 ASD 的儿童中存在针对叶酸受体 α （FRα） 的自身抗体，其中相当多的儿童对口服亚叶酸有反应，言语、语言和社交互动总体改善。通过测量血清中针对 FRα 的自身抗体来诊断叶酸受体自身免疫性疾病，为治疗和预防叶酸受体自身免疫性疾病的病理后果提供了潜力的标志物。
关键词：自闭症谱系障碍;叶酸受体 α;叶酸;怀孕;大脑发育;胎儿发育
1. 背景
叶酸是叶酸 （B9） 的代谢活性形式的总称，是基本细胞代谢所必需的 B 族复合维生素，包括但不限于必需的细胞 DNA 合成、修复和甲基化，包括调节单胺类神经递质的合成和代谢。作为绿叶蔬菜、豆类和水果中的一种营养物质，它在从聚谷氨酸分解为单谷氨酸后很容易被小肠上部吸收。活性形式的叶酸促进一碳转移反应，并有助于嘌呤、嘧啶和氨基酸的合成 [1]。它最典型的作用之一是促进单碳转移到同型半胱氨酸以形成蛋氨酸。该反应对于维持细胞内 S-腺苷甲硫氨酸至关重要，而 S-腺苷甲硫氨酸是甲基化反应的必需化合物。叶酸还与维生素 B 呈相互依赖关系12因为这两种维生素必须以足够的量存在才能转化为参与代谢反应的生理形式。如果叶酸和 B12不充分，细胞代谢和复制中断 [2,3]。这在胎儿和新生儿发育过程中最为关键，因为在此期间叶酸不足会导致大脑发育中断，从而导致结构异常，从而产生 CFD 综合征的功能缺陷。脑脊液 （CSF） 叶酸水平低是 CFD 综合征的一个特征，Ramaekers 和 Blau 首先描述了这一点 [4]。在极少数情况下，CFD也可能由FRα基因突变引起[5,6,7]，但CFD患者脑脊液中叶酸水平低的最常见原因是存在抗叶酸受体抗体（anti-folate receptor antibody， FRAb），该抗体可阻断叶酸经脉络丛的转运[8,9]。最近的一份报告确定了被诊断患有 CFD 综合征的儿童的 CIC 转录因子基因突变。CIC 基因突变会降低 FRα 的表达，从而减少叶酸通过脉络丛的转运 [10]。在 ASD 中未发现 FRα 基因异常，但这些儿童中的大多数 FRAb 阳性且 CSF 叶酸水平较低 [11,12]。这是先验证明，在生理叶酸状态下，FRα 是叶酸进入大脑的主要转运蛋白。
2. 怀孕期间的叶酸需求
自从发现叶酸在巨幼红细胞性贫血和脊柱裂中的作用以来，怀孕期间补充叶酸和强化食品已成为治疗和预防叶酸缺乏症的两种全球公认的方法。妊娠期基本叶酸需求量增加 75% 至 100%（每天约 300-400 μg），因为叶酸在胚胎/胎儿的生长发育中起着关键作用，尤其是在发育的早期阶段 [13]。因此，通常的做法是建议女性在受孕前和整个怀孕期间在饮食中补充叶酸。预防妊娠期叶酸缺乏症是通过在妊娠早期摄入至少 0.4 mg/d 的叶酸来实现的 [14,15]。鉴于最近发现的可阻断叶酸转运的 FRAb，这些抗体阳性的女性可能需要额外补充亚叶酸，以便为发育中的胎儿提供足够的叶酸 [16,17]。
3. 叶酸和胎儿大脑发育
叶酸在胚胎和胎儿大脑发育过程中的重要性已在遗传动物模型和叶酸缺乏症的饮食作中得到证实[18,19]。如果叶酸运输或循环中的叶酸浓度受到不利影响，胚胎和胎儿发育就会显着改变。编码叶酸受体α（FRα）的FOLR1等基因的小鼠敲除模型在窝中产生致死性，同时伴有眼眶面部异常、先天性心脏缺陷和/或神经管缺陷[20]。在 FOLR1 敲除小鼠中，可以通过补充足够的亚叶酸（N5-甲酰四氢叶酸，一种还原形式的叶酸）来防止这些致死。之所以出现这些显著的结果，是因为在神经形成的早期阶段和出现异常的区域，KO小鼠缺乏叶酸转运[21]。在啮齿动物模型中，叶酸缺乏会导致祖细胞减少和细胞凋亡增加，这可能导致不孕或胚胎吸收或胎儿畸形 [22]。行为缺陷见于叶酸缺乏的母亲所生的大鼠幼崽[23]和怀孕期间甲基供体缺乏的饮食[24]。在妊娠期间暴露于大鼠叶酸受体抗体的大鼠模型中，报道了胚胎吸收以及颅面区域和大脑的畸形 [25]。当抗体以较低剂量给药时，胚胎被携带到足月，出生的幼仔看起来正常。然而，这些幼崽表现出严重的行为缺陷[23,26]。在抗体暴露前用亚叶酸和地塞米松治疗可以挽救这种行为表型 [27]。这些研究为暴露于 FRα 抗体的病理后果和亚叶酸的保护作用提供了强有力的证据。
4. 叶酸与新生儿大脑发育
出生后，后代的饮食中含有足量的叶酸至关重要。出生后发育需要叶酸进行神经祖细胞分化和增殖，而不是胚胎发生所需的快速细胞分裂[28]。叶酸作用的详细机制尚未完全阐明，但动物模型在出生后早期发育过程中产生的叶酸缺乏说明了叶酸在预防发育和认知缺陷方面的重要性[23,27]。研究人员还报道了大鼠模型中神经元兴奋性和维持性的变化，这些变化随着脑叶酸的减少而出现[29]。其他研究报道了神经元和星形胶质细胞中 p53 的增加和同型半胱氨酸积累的迹象 [30]。对这些动物的运动功能和认知有长期影响。因此，叶酸对于维持神经元功能也是必需的。基于此，有必要进一步研究神经元和大脑支持细胞中叶酸代谢的机制。到目前为止，叶酸与损伤后的神经元修复和分化、髓鞘形成和维持以及神经元可塑性有关[30,31,32]。图 1 总结了叶酸缺乏对胎儿和产后大脑发育的影响，以及导致神经功能缺损的后遗症。

图 1.叶酸缺乏对胎儿和大脑发育的影响。多种原因导致全身性叶酸缺乏症和胎儿叶酸缺乏症。叶酸受体自身抗体可以阻止叶酸向胎儿、胎儿和新生儿大脑的运输。除了叶酸缺乏外，免疫介导的炎症也会导致病理。这对大脑发育和功能有多管齐下的影响。
5. 叶酸受体：表达和功能
在人类中，有四个基因编码叶酸受体（见表 1）。这些受体中最具特征的是叶酸受体 α （FRα）。作为细胞外受体，FRα、FRβ、FRγ 和 FRδ 作为叶酸转运蛋白跨不同靶组织发挥作用 [33,34]。FRα 也可以作为转录因子 [33]。叶酸的其他转运蛋白包括还原叶酸载体（RFC），它需要高局部浓度（微摩尔）的生物活性还原型叶酸，以及质子耦合叶酸转运蛋白（PCFT），它只能在酸性条件下运输叶酸和叶酸，是参与肠道吸收叶酸的主要转运蛋白[35]。
表 1.叶酸转运蛋白总结。

6. FRα 在母胎叶酸转运中的作用
怀孕期间对叶酸的高需求需要稳态机制，以确保在整个发育过程中为胎儿提供足够的叶酸。作为叶酸转运蛋白家族中最具特征的受体，公认的 FRα 介导的转运机制是叶酸结合后全受体的易位/内吞作用 [35]。FRα 在所有上皮细胞上表达，包括脉络丛。它在生殖组织中高度表达，包括胎盘和胎儿。为了确定妊娠期叶酸在胎盘中运输的机制，Yasuda等[41]纵了渗透压、磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C抑制的浓度和叶酸酶C的浓度3人胎盘的 H-叶酸体外培养刷取边界膜囊泡，并确定 FRα、RFC 和 PCFT 可以运输各种形式的叶酸，但大约 60% 的叶酸与 FRα 结合。他们还指出，Wistar 大鼠的叶酸需求量在整个妊娠期间增加，转运蛋白 mRNA 的表达也增加。
7. FRα 在叶酸运输到大脑中的作用
FRα 被认为是叶酸进入大脑的主要转运蛋白。然而，研究 FRα 如何跨血脑屏障运输叶酸存在局限性。Grapp等[42]描述了叶酸转运穿过脉络丛进入大脑的一种潜在机制。在他们在培养物和小鼠模型中使用永生化 Z310n 大鼠脉络丛细胞的实验中，他们确定叶酸的运输需要通过外泌体将叶酸从脉络丛的基底外侧穿梭到顶端侧的脑实质。RFC和PCFT等替代转运蛋白可能仅在FRα表达和转运中断时发挥作用，并且受体局部提供足够的叶酸浓度[43]。梭穿梭穿过脉络丛的上皮内层是一种推测在所有表达 FRα 的组织中都是保守的机制 [44]。
8. 叶酸受体自身抗体：它们在破坏叶酸运输中的作用
在某些情况下，叶酸利用中断与饮食缺乏无关，但很可能是由于遗传或代谢异常导致叶酸运输紊乱。叶酸运输中断的一个新罪魁祸首是叶酸受体自身免疫性疾病，其中针对 FRα 的自身抗体会干扰叶酸向胎儿的运输;它与胎儿不育、受孕困难、流产和神经管缺陷有关[16,17,45,46]。
在婴幼儿中，这些抗体可以阻止叶酸向大脑的运输。在诊断为脑叶酸缺乏综合征或孤独症谱系障碍的儿童中，约有70%的脑脊液叶酸水平低，且对亚叶酸治疗有反应[47,48]。大多数自身抗体属于 IgG 类，因此很容易穿过胎盘并影响胎儿。已鉴定出两种不同类型的抗体。一种在叶酸结合的活性位点与 FRα 结合，因此阻断叶酸结合（阻断 Ab）。另一种类型的抗体与不参与叶酸结合（结合 Ab）的抗原位点结合，但可以触发免疫反应和炎症，并使受体失去功能。在大多数情况下，存在一种或两种类型的抗体[49,50]。因此，叶酸运输和炎症的功能阻断是病理学的一个组成部分 [44]。
9. 叶酸受体抗体的病理后果
叶酸受体自身抗体的存在会破坏叶酸的运输，细胞对叶酸摄取减少的后果会影响胎儿的发育，尤其是中枢神经系统。叶酸受体抗体与神经管缺陷妊娠也存在相关性 [16]。在不太严重的情况下，一部分出生时在子宫内暴露于母体 FRα 自身抗体的儿童在出生后会发展为低功能自闭症，伴或不伴神经功能缺损。最近的研究表明，叶酸受体自身抗体与儿童自闭症谱系障碍存在显著关联 [11,51,52]。
10. 叶酸受体自身免疫性疾病的诊断
可能由于母体叶酸缺乏或叶酸受体自身抗体而引起的脑叶酸缺乏的早期迹象，可以通过测量妊娠期间母亲的血清叶酸、同型半胱氨酸和叶酸受体自身抗体来推断。除了膳食叶酸缺乏症外，孕妇体内的叶酸受体自身抗体也会导致胎儿叶酸缺乏症。在后一种情况下，叶酸跨胎盘运输的阻断和抗体介导的炎症可能导致病理，如妊娠期间暴露于大鼠叶酸受体抗体的大鼠模型所示[26,27]。在婴儿中，血液中存在叶酸受体自身抗体可能提供一种机制，通过这种机制可以阻断叶酸通过脉络丛向大脑的运输，从而导致脑叶酸缺乏[51,52]。因此，确定孕妇和儿童血液中叶酸受体自身抗体的存在成为证明或排除叶酸受体自身免疫性疾病的必要测试。
测定血清中抗体滴度的方法已成熟。目前已报道了两种不同类型的IgG和/或IgM抗体[50]。这些抗体可以是阻断和/或结合抗体。由于抗原/抗体相互作用，这两种类型的抗体都能够触发免疫反应，导致局部炎症，这可能会干扰叶酸通过 FR 蛋白的运输。两种类型的检测都可以在实验室环境中进行，如下所述。
11. 阻断抗体检测
使用功能结合放射性测定法测定阻断 FRα 的自身抗体。用 300 μL 0.1 M 甘氨酸/HCl pH 2.5/0.5% Triton X-100/10 mM EDTA 酸化患者的血清 （200 μL），并加入单独试管中的 12.5 mg 木炭颗粒中（250 μL 5% 木炭/1% 葡聚糖，溶于 0.1 M Na PO4 pH 7.4/0.5% Triton X-100/10 mM EDTA，旋转并吸出上清液）以去除任何内源性叶酸， 上清液的 pH 值用 40 μL 1 M 二元 NaPO4 中和，然后再用于测定。通过将纯化的载脂蛋白人 FRα 蛋白 （40 ng） 添加到处理过的血清中并在 4 °C 下孵育过夜来进行该测定。 第二天，3加入H-叶酸（700pg）（Moravek）并在室温下孵育20分钟。松散3用葡聚糖包被的木炭 （200 μL） 除去 H 叶酸，然后3通过在液体闪烁计数器中对样品进行计数来确定与 FRα 结合的 H 叶酸。减少3与阴性对照血清样品相比，载脂蛋白人 FRα 的 H-叶酸可以测量样品中存在的阻断自身抗体 [50]。阻断抗体可以是 IgG 或 IgM;这些值表示为3每毫升血清的 HPGA 封闭剂，滴度范围为 >0.2 至 0.5（低滴度）、>0.5 至 1.0（中等滴度）或 >1.0（高滴度）。
12. 结合抗体的测定
IgG 自身抗体与叶酸受体 α （FRα） 的结合是通过基于 ELISA 的方法测定的。将从母乳中纯化的 FRα（100 μL 中 1 μg）添加到 ELISA 板的每个孔中，以将蛋白质共价结合到马来酸酐包被的孔中（Thermo Fisher，Waltham，MA，USA）。通过用正常山羊血清 （200 μL） 处理过夜封闭其他位点以防止与孔的非特异性结合后，将血清样品（4 和 8 μL）（阴性对照、阳性对照和患者样品）与 100 μL 新鲜山羊血清一起加入孔中，并在 4 °C 下孵育过夜，以促进自身抗体与孔中的 FRα 结合。洗涤孔以去除未结合的蛋白质后，通过与过氧化物酶偶联的抗人 IgG 二抗（1：6000 稀释）（Vector Labs）在室温下孵育 1 小时来检测每个孔中结合的特异性 IgG 自身抗体。洗涤以去除未结合的二抗后，通过与 ultra TMB （Thermo Fisher） 孵育 10 分钟来测定结合的过氧化物酶偶联的二抗。用 100 μL 1.0 M HCl 将所得蓝色反应转化为黄色，然后在 ELISA 读板器中读取 450 nm 处的吸光度。在第二组孔中，使用蛋白 A 包被板中捕获的已知量的人 IgG 构建标准曲线 [50]。该值表示为每毫升血清中 IgG 抗体的皮摩尔数，范围为 >0.1 至 0.5（低滴度）;>0.5 至 2.0（中等滴度）和 >2.0（高滴度）。
除其他标准外，使用上述测试可确认叶酸受体自身免疫性疾病的特异性诊断。校正背景后，对于封闭抗体，0.2 pmole 或更高的值被视为阳性，对于结合抗体，0.1 pmole 或更高的值被视为阳性。由于叶酸受体 α 是一种外周膜蛋白，因此在血清中测得的抗体滴度应被视为膜结合抗原饱和后循环中出现的过量抗体。据报道，随着时间的推移，同一个体的抗体滴度会发生变化，范围从低到中等滴度或检测不到的水平。虽然抗体滴度发生这些变化的原因尚未确定，但细胞上 FR 抗原的变化、肠道中牛奶 FR 抗原的暴露以及特定 B 细胞群可能是促成因素。
13. ASD 中 FRα 自身免疫性疾病的治疗
在发育障碍中，ASD 最为普遍，并且在过去十年中持续增加。根据现有出版物，WHO 报告的全球患病率为 1/162 新生儿 [53]。在美国和加拿大，据报道患病率为 1/50，预计这一比例在未来几年内会上升 [54]。虽然 ASD 的临床表型可能由多种遗传、表观遗传和环境因素引起，但叶酸等营养缺乏可能起重要作用。叶酸受体抗体和脑叶酸缺乏症在 ASD 中普遍存在。ASD 中 FRα 自身免疫的治疗基于我们之前在婴儿发病 CFD 综合征和与神经功能缺损相关的低功能自闭症中的发现 [11]。在这些儿童中，亚叶酸治疗3-6个月后重复进行脑脊液分析，显示5-甲基-四氢叶酸水平恢复正常[11,51]。与血浆中的生理叶酸浓度相比，每天分 1 次补充高剂量 dl-亚叶酸（亚叶酸）（0.5-2 毫克/公斤体重或 0.25-1.0 毫克左旋叶酸），5-甲基四氢叶酸浓度增加 100 倍以上。尽管自身抗体诱导阻断了 FRα 途径以将叶酸转运到脉络丛中，但血浆中 5-甲基四氢叶酸和亚叶酸的显着增加将使还原叶酸载体-1 （RFC-1），一种高容量/低亲和力的跨膜叶酸转运蛋白在血脑屏障上，将足够的 5-甲基四氢叶酸和亚叶酸转运到大脑。在这种情况下，验证正常的维生素 D 状态似乎很重要，因为 RFC-1 基因转录取决于血脑屏障微血管细胞内维生素 D 的可用性 [40]。
另一种重要的治疗干预措施是严格不含动物源性奶或奶制品的饮食，这些奶制品可以用其他植物奶制品（例如豆奶、杏仁奶和大米奶以及椰奶）代替。尽管之前已经进行了许多关于酪蛋白/无麸质饮食的研究，但目前还没有最终证据表明这些饮食治疗对 ASD 的管理有益。许多研究最多只进行了 3 个月，尽管一些对少数患者的研究是在 1 到 2 年内进行的，并表明自闭症的部分核心症状有所改善 [55,56,57,58]。结论是，应尝试酪蛋白/无麸质饮食至少 6 个月，才能在 ASD 人群子集中看到积极反应。一种提出的假设是，来自牛奶酪蛋白的阿片类肽与自闭症的发病机制有关[59]。由于牛奶中含有可溶性形式的 FRα 蛋白，与人 FRα 具有 91% 的同源性，因此我们检查了人 FRα 自身抗体与从人胎盘中分离的不同 FRα 抗原的结合特性;人乳;以及牛奶、山羊奶和骆驼奶。发现自身抗体对来自牛奶和骆驼奶的可溶性 FRα 蛋白的交叉反应性最高（图 2）。为了确定所饮用牛奶中的 FRα 是否会导致自身免疫性疾病，我们研究了无牛奶饮食对 FRα 抗体阳性儿童的影响。与 FRα 抗体相关的婴儿 CFD 综合征患者被随机分配接受无牛奶饮食或正常的含奶饮食。在正常饮食的儿童中，在 6-12 个月的评估期间，FRα 抗体从基线增加到更高的滴度。然而，接受无奶饮食的儿童在 3-6 个月后 FRα 抗体滴度显着下降，在重新引入牛奶后再次上升。这些研究证实，严格无动物奶饮食后 FRα 抗体的下调 [55]。在这组婴儿 CFD 综合征患者中，一些患者还患有伴有神经功能缺损的低功能自闭症，并在无奶饮食后表现出临床反应。这些发现表明，在易感个体中，源自牛和其他动物源性奶制品的可溶性 FRα 抗原充当抗原，通过形成特异性 B 细胞克隆触发肠道免疫反应，产生进入循环的自身抗体，与锚定在脉络丛上的人 FRα 发生交叉反应，并阻止叶酸从循环中转运到脑脊液 [44，甲状腺功能障碍在 ASD 儿童中很常见。尽管 FRα 在甲状腺中的表达在年龄较大的儿童和成人中降低，但在胎儿和新生儿甲状腺中高表达，并且 FRα 抗体可影响甲状腺的发育 [61]。自闭症谱系障碍患者的首选策略是在接触奶制品约 2-3 周后采集血清样本以确定 FRα 自身抗体。在这项诊断性血液测试之后，自闭症儿童可以接受无动物奶的饮食。一旦 FRα 自身抗体检测呈阳性，就可以继续进行无牛奶饮食干预，同时口服高剂量的亚叶酸。其他减少 FRα 自身抗体的治疗策略可能是使用类固醇或静脉注射免疫球蛋白进行免疫抑制，但这些治疗选择应仅用于紧急情况，例如难治性癫痫发作或剧烈运动障碍，例如肌张力障碍、舞蹈手足徐动症或弹道炎。

图 2.（A） 牛奶中的叶酸受体浓度。（B） 阻断自身抗体针对各种 FR 抗原的免疫交叉反应性。通过测试来自牛奶的 FR 抗原摩尔量相等的 8 名不同患者的血清样本中已知量的封闭活性来进行封闭测定。封闭活性被确定为 pico 摩尔3HPGA 阻断并与母乳抗原中的阻断进行了比较。
在 FRα 自身免疫阳性的 ASD 儿童亚组中，即伴有神经功能缺损的低功能自闭症，用高剂量亚叶酸治疗显示核心自闭症症状的临床改善和先前降低的 CSF 5-甲基四氢叶酸恢复正常 [51]。一项针对无额外神经功能缺损的ASD患儿进行的双盲、安慰剂对照研究显示，接受亚叶酸治疗后，FRAb阳性受试者的言语评分显著改善[48]。最近在无其他神经系统并发症的低功能自闭症儿童中进行了一项自我对照临床试验。在这些研究中，发现 FRα 抗体的患病率高达 76%。这些儿童还因选择性饮食习惯和营养不良而患有多种营养缺乏症。营养不足的联合纠正和高剂量亚叶酸给药导致从严重自闭症到轻度至中度自闭症的整体显着恢复（图 3A）。治疗 2 年后儿童自闭症评定量表 （CARS） （亚叶酸补充和纠正异常营养值）与基线时的 CARS 比较显示，阻断型 FRα 抗体滴度阴性或低的儿童，高达 0.44 pmol FRα 阻断/mL 血清，与 FRα 抗体滴度高于 0.44 的组相比。基线 CARS 评分随治疗开始年龄的增加而增加。接受治疗的自闭症儿童的年龄较大的亚组的结果变得更差（图 3B）。母体和父系自身抗体的存在以及胚胎暴露于这些抗体可能会进一步加剧这一结果。初步数据表明，在母体或亲本 FRα 自身抗体的情况下，儿童治疗后的结果也不太理想（图 3C）。

图 3.（A）. 与CARS保持不变的未经治疗的自闭症患者（n = 84）相比，接受亚叶酸治疗并纠正营养缺陷的组显示基线CARS评分从重度（n = 82;CARS 平均值± SD：41.34 ± 6.47）至中度或轻度自闭症（平均 ± SD：34.35 ± 6.25;配对 T 检验 P < 0.0001）。作为年龄的函数，基线 CARS（蓝色条）随着年龄的增长而缓慢增加，而 2 年治疗期后的 CARS（橙色条）在所有年龄亚组中显着减少。随着年龄的增长，基线 CARS 的增加将对老年人群的最终结局产生不利影响，尤其是 6 岁以上。该图表示治疗结果与儿童 （K）、母亲 （M） 和父亲 （F） 的特定 FRα 抗体谱的函数关系。母体 FRα 抗体的存在或父母双方存在抗体都会对治疗结果产生负面影响（改编自 [51]）。
与父母 FRα 抗体检测保持阴性的婴儿发病 CFD 综合征相比，对自闭症儿童父母的检测显示，母亲和 29% 的患病率在父亲中为 29%，而在健康对照组中为 3% [51]。另一项研究还证实，自闭症儿童的 FRα 自身免疫患病率相同 （76%），而未受影响的兄弟姐妹 （75%）、父亲 （69%） 和母亲 （59%） 的自身抗体患病率甚至更高 [62]。这些抗体的外观可能具有家族遗传起源，但患 ASD 的风险可能受到其他未知因素的影响，因为一些对这些抗体呈阳性的兄弟姐妹没有症状。自闭症发展的两个可疑决定因素是在生命前 18 个月神经发育过程的关键阶段出现抗体以及胎儿暴露于母体抗体。
与 FRα 自身免疫相关的自闭症亚叶酸治疗后的结果似乎受多种因素的影响，例如 FRα 抗体滴度水平和开始治疗的年龄，以及父母的 FRα 抗体谱。在我们关于亚叶酸治疗后两年治疗结果的研究中，我们只包括了婴儿发病自闭症儿童组，他们被排除了遗传异常，因为遗传缺陷可能构成对 FRα 自身免疫影响的统计评估的偏倚（图 4）。

图 4.亲本抗体状态对后代发育结果（上图）和后代出生后抗体发育（下图）的重要性。
14. 妊娠期 FR 自身免疫性疾病的治疗
FRα自身免疫与后代神经管缺陷（neural tube defect， NTD）和其他先天性畸形的高风险有关[16,17]。其他独立研究也证实了这一点[63,64]。尽管爱尔兰人群中 NTD 的发病率很高，但对该人群中 FRα 自身抗体的评估未能显示与 NTD 妊娠的相关性具有统计学意义 [65]。然而，该研究表明，母亲以及男性和女性对照中 FR 抗体的患病率较高 （35-40%）。由于 FRα 抗体未在 NTD 患儿的父亲中进行评估，而仅在对照组的无血缘关系的男性中进行评估，因此不能排除父母双方 FRα 抗体阳性的可能性对 NTD 结局的影响。ASD 的父母研究表明，母系和父系对 ASD 结局的发生率和严重程度都有影响 [51]。食品中的叶酸强化已将 NTD 的患病率降低了 30-50%。然而，对于叶酸状态正常但 FRα 自身抗体检测呈阳性的女性，我们怀疑即使每天添加 400-800 μg 或 1000 μg 的双胎妊娠剂量也可能无法预防 NTD 或先天性畸形，因为在 FRα 抗体存在的情况下胚胎和胎儿叶酸缺乏持续存在。
一份病例报告描述了一名妇女，在三次妊娠后的随访中，发现其阻断型和结合型血清 FRα 自身抗体滴度高。她之前曾两次流产，第三次怀孕，一对同卵双胞胎，在此期间，她每天服用 1 毫克叶酸。然而，一名双胞胎在 12 周时因脑膨出而减少，另一名双胞胎因左心发育不良综合征和脉络丛囊肿而终止妊娠。此时，广泛的基因检测未发现任何异常。在发现 FRα 自身抗体后，无奶饮食治疗能够降低 FRα 抗体滴度，但 IVF 第四次怀孕也导致 5 个月后流产。只有在继续无奶饮食并加入 4 mg 叶酸、2.5 mg 亚叶酸和 5 mg 泼尼松后，FRα 抗体滴度才下降到检测不到的水平，第五次怀孕足月并导致一名健康的男婴出生 [17]。FRα 自身抗体与不孕和早产显著相关 [45,46]，早产儿的 ASD 患病率更高 [66]。因此，对育龄妇女进行 FRα 抗体检测可能有助于通过早期干预预防其中一些疾病。
15. 预防 FR 抗体引起的 ASD 和相关并发症
ASD 的预防尚未报道。然而，为了能够进行进一步的评估，包括血清 FRα 自身抗体检测，尽早诊断 ASD 似乎非常重要。我们认为，一旦高度怀疑ASD并在3岁之前尽早发现FRα抗体，如果母体FRα抗体或父母双方抗体均为阴性，则及时使用大剂量亚叶酸联合无动物奶饮食治疗后的结果将产生良好的结果[51]。
目前，只有在怀疑或诊断出 ASD 后才进行 FRα 抗体检测。然而，该手术会延迟治疗并导致显着延迟，从而对预后产生不利影响。因此，卫生工作者可以在 18 或 24 个月时使用改良的幼儿自闭症检查表（M-CHAT 测试）或其他工具对自闭症进行早期筛查，尽管在早期使用这些测试时缺乏对 ASD 的最佳敏感性和特异性。
另一种选择是在 12 至 18 个月大的早期进行 FRα 抗体筛查测试，尤其是在那些怀疑表现出一种或多种自闭症体征或症状的儿童中。FRα 抗体检测呈阳性的儿童可以接受无动物奶饮食，并接受亚叶酸补充剂，并对这些儿童进行强制性随访。
16. 研究结果的临床意义
自从一个多世纪前发现叶酸以来，其缺乏的血液学后果及其在 DNA 合成和巨幼红细胞性贫血治疗中的作用已经明确。新兴研究旨在确定其在甲基化反应、基因表达的表观遗传调控、生殖功能、怀孕和胎儿发育中的作用。越来越明显的是，叶酸不仅在胎儿大脑发育中起着重要作用，而且在成熟大脑的出生后发育和功能整合的细化中也起着重要作用。在 ASD、精神分裂症、抑郁症和痴呆患者中观察到的亚叶酸治疗反应的临床改善证明了叶酸在脑功能代谢调节中的作用，可能是通过调节神经递质的表达和加工。虽然传统思维会将叶酸代谢的破坏与营养叶酸缺乏和叶酸途径的基因缺陷联系起来，但导致胎儿和大脑叶酸缺乏的叶酸受体自身抗体的鉴定对我们目前关于叶酸运输到大脑及其在调节大脑功能中的作用的想法提出了挑战。因此，临床识别脑叶酸缺乏症对于我们理解神经发育和神经精神疾病至关重要。
为预防胎儿叶酸缺乏症，治疗 FRα 抗体检测呈阳性的未来父母的具体指南应考虑受孕前补充亚叶酸的时间范围和剂量，对于母亲，应考虑怀孕期间使用的亚叶酸剂量。评估最佳剂量以提供足够的叶酸补充但避免过量服用非常重要，特别是因为缺乏关于整个怀孕期间服用高剂量亚叶酸的安全性的数据。根据用于治疗 CFD 和 ASD 的高剂量亚叶酸的安全性，人们可以推测每日 5-10 毫克的剂量可能在安全范围内。左旋叶酸酯的未来可用性可以将该剂量减少一半。为了获得 CFD 和 ASD 的良好结果，早期检测 FRAb 和亚叶酸治疗可能会防止神经功能缺损的发展。
17. 结束语
几十年来对神经管缺陷妊娠的研究只能通过补充叶酸来降低其发病率，但并不能完全预防它们。另一方面，ASD 的发病率持续上升，尚未确定明确的促成原因。公共和私人资助机构都投入了大量可用资金用于鉴定基因缺陷和基因组多态性，但无济于事。已经花费了大量资金来开发基因缺失小鼠和大鼠模型以识别自闭症基因。现在很明显，ASD 不是一种先天性遗传病，也不遵循孟德尔遗传。因此，ASD 发病机制的答案必须在于广泛影响基因表达的表观遗传和环境因素。叶酸在 DNA/RNA 合成、甲基化和基因表达的表观遗传控制中起关键作用，因此，在发育的关键阶段叶酸可用性降低，尽管存在 FRAb 阻断叶酸转运并引发炎症，可能在 ASD 的病理学中起重要作用。




作者贡献
所有作者对手稿的构思、写作和定稿做出了同等贡献。所有作者均已阅读并同意手稿的已发表版本。
资金
Quadros 实验室正在进行的研究得到了 Brain Foundation 和 Vembu Srinivasan 家族基金的资助。NBK得到了美国纽约州史坦顿岛纽约市资助的基础科学研究所的研究生奖学金的支持。
机构审查委员会声明
不適用。
知情同意书
本研究报告的所有受试者均获得知情同意。
数据可用性声明
不適用。
利益冲突
其中两位作者（J.M.S. 和 E.V.Q.）是颁发给纽约州立大学研究基金会的美国 FRalpha 自身抗体检测专利的发明人。
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